張璐等

摘 要 建立了在線凈化（TurboFlow， TF）超高效液相色譜同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中硝基咪唑類及其代謝物（甲硝唑，羥基甲硝唑，二甲硝咪唑，羥基二甲硝咪唑，洛硝噠唑，異并硝唑，羥基異并硝唑，奧硝唑）的方法。以0.1%甲酸溶解樣品后，進入TF超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)分析，以內(nèi)標法定量。對影響凈化的條件如TF凈化柱、流動相、洗脫溶液等進行優(yōu)化。

1 引 言

硝基咪唑類（Nitroimidazoles， NMZs）藥物是一類含有5位硝基取代咪唑雜環(huán)的化合物，主要包括甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、羥基甲硝唑（1（2hydroxyethyl）2hydroxymethyl5nitroimidazol，MNZOH）、二甲硝咪唑（Dimetridazloe，DMZ）、羥基二甲硝咪唑（2Hydroxymethyl1methyl5nitroimidazole，HMMNI）、洛硝噠唑（Ronidazole，RNZ）、異并硝唑（Ipronidazole，IPZ）、羥基異并硝唑（IpronidazoleOH，IPZOH）、奧硝唑（Ornidazole），該類藥物作為飼料添加劑應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。硝基咪唑類藥物因療效明顯且價格低，被許多蜂農(nóng)用于預防和控制蜜蜂孢子蟲病[1]，造成該類藥物在蜂蜜中殘留。由于該類藥物具有致癌性、致突變性，許多國家及地區(qū)已禁止該類藥物用于食源性食物，我國已于2002年禁止該藥物的使用[2]。另外，硝基咪唑代謝物在動物體內(nèi)比原藥維持時間長[3]， 以二甲硝咪唑為例，在給家禽喂藥2 d后，肌肉組織中未檢出原藥殘留，1 d后在蛋中檢測到其代謝物。因此，硝基咪唑類藥物的代謝產(chǎn)物的檢測備受關(guān)注[4，5]。

硝基咪唑類藥物及代謝物的檢測方法主要有高效液相色譜法[6，7]、液相色譜質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜法[8～10]、氣相色譜質(zhì)譜法[11]、毛細管電泳法[12]、膠束電動色譜法[13]等。這些方法均需要對樣品進行大量前處理。一般多采用液液萃取法[9，14]、固相萃取法[15～17]等，盡管上述方法對藥物殘留均可起到凈化效果，但費時費力。與傳統(tǒng)的提取方法相比，在線凈化（TF）技術(shù)通過擴散溶解、尺寸排阻、柱層析等技術(shù)將蛋白等一些大分子物質(zhì)濾掉，保留目標小分子； 并通過與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，簡化前處理流程、在實現(xiàn)在線凈化功能的同時保證了方法的檢測靈敏度。目前利用該技術(shù)已建立了牛奶中孕激素[18]、動物源食品中金剛烷胺[19]、水果中農(nóng)藥殘留[20]以及環(huán)境水中磺胺類[21]、皮質(zhì)類固醇[22]、苯并三唑類化合物[23]的檢測方法。但還未見利用此技術(shù)研究蜂蜜中硝基咪唑及其代謝物的檢測方法。本研究利用TFUPLCMS/MS系統(tǒng)建立了蜂蜜中硝基咪唑及其代謝物殘留量的檢測方法。本方法簡便、快速、結(jié)果準確可靠，并成功應用于本實驗室日常檢測工作。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Transcend1在線凈化系統(tǒng)（美國ThermoFisher 公司），配有TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜儀； 離心機（美國Sigma公司）； GeNius 3多功能渦旋器（德國IKA公司）； Milli1 advantage A10/Elixs超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

MNZ，DMZ，RNZ，IPZ，IPZOH（純度>98%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）； MNZOH，HMMNI，DMZd3，HMMNId3，IPZOHd3（純度>97%，德國Witega公司），奧硝唑（純度>98%，SigmaAldrich公司）。乙腈（HPLC級，美國ThermoFisher公司），甲酸（HPLC級，上海安普公司）。實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）。

2.2 溶液配制

標準溶液的配制： 分別準確稱取MNZ，DMZ，RNZ，IPZ，IPZOH，MNZOH，HMMNI，DMZd3，HMMNId3，IPZOHd3和奧硝唑各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 g/L的標準儲備液，4 ℃下保存。

3.5 實際樣品分析

采用本方法對30批蜂蜜中的硝基咪唑及代謝物殘留進行測定。每批樣品從稱樣到檢測完畢只需15 min。與傳統(tǒng)固相萃取LCMS/MS檢測相比，樣品分析時間大大縮減。

實際檢測結(jié)果顯示，在1批蜂蜜中檢出DMZ，含量為0.98 μg/kg。其余29批蜂蜜樣品中硝基咪唑及代謝物均未檢出。

4 結(jié) 論

建立了在線凈化超高效液相色譜同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中硝基咪唑類及其代謝物殘留的方法。樣品經(jīng)溶解離心后的上清液無需復雜的前處理過程即可直接進樣。與常規(guī)方法比較，本方法快速、簡便、方便，提高了工作效率，降低了樣品的分析成本。本方法的靈敏度高，穩(wěn)定性好，能很好地應用于蜂蜜中硝基咪唑類及其代謝物殘留的檢測。

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21 GarcíaGaln M J， DíazCruz M S， Barceló D. Talanta， 2010， 81： 355-366

22 Fayad P B， Prévost M， Sauvé S. Talanta， 2013， 115： 349-360

23 Liu R Z， Ruan T， Wang T， Song S J， Guo F， Jiang G B. Talanta， 2014， 120： 158-160

Determination of Nitroimidazoles and Their Metabolites Residues in

Honey by TurboFlow Online PurificationUltra Performance Liquid

ChromatographyTandem Mass Sepctrometry

and Istopes Dilution Technique

ZHANG Lu*1， KONG XiangHong1， WANG Han1， LI JianHua， HE Qiang1， XU NiuSheng2

1（Shannxi EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Xi′an 710038， China）

2（Thermo Fisher Scientific （China）， Shanghai 201206， China）

Abstract A TurboFlow （TF） online purificationultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometric method was developed for the determination of nitroimidazoles and their metabolites （ornidazole， IPZ， MNZ， MNZOH， DMZ， RNZ， IPZOH and HMMNI） in honey. The honey sample was extracted by H2O containing 0.1% formic acid solution. Then， the extraction solution was analyzed by TFUPLCMS/MS. The main factors influencing the purification efficiency including TF column， mobile phases and elution solutions were optimized. The compounds were detected by selective reaction monitoring （SRM） in positive ion mode electrospray ionization （ESI+）. The linear range of the method ranged from 0.1 to 50 μg/L for nitroimidazoles and their metabolites， with the correlation coefficient （R2） of over 0.997. The limits of quantification were 0.1 μg/kg for ornidazole， IPZ， 0.2 μg/kg for MNZ， MNZOH， DMZ， RNZ and IPZOH， and 1.0 μg/kg for HMMNI， respectively. The recoveries were in the range of 73.7% to 116.4% at four spiked levels with the relative standard deviations ranged from 1.1% to 9.1% in honey samples. The results indicate that the developed method is simple， efficient and precise， and can be used for the determination of nitroimidazoles and their metabolites in the actual honey samples.

Keywords TurboFlowultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Nitroimidazoles and metabolites； Honey

（Received 9 September 2014； accepted 10 October 2014）

21 GarcíaGaln M J， DíazCruz M S， Barceló D. Talanta， 2010， 81： 355-366

22 Fayad P B， Prévost M， Sauvé S. Talanta， 2013， 115： 349-360

23 Liu R Z， Ruan T， Wang T， Song S J， Guo F， Jiang G B. Talanta， 2014， 120： 158-160

Determination of Nitroimidazoles and Their Metabolites Residues in

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ZHANG Lu*1， KONG XiangHong1， WANG Han1， LI JianHua， HE Qiang1， XU NiuSheng2

1（Shannxi EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Xi′an 710038， China）

2（Thermo Fisher Scientific （China）， Shanghai 201206， China）

Abstract A TurboFlow （TF） online purificationultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometric method was developed for the determination of nitroimidazoles and their metabolites （ornidazole， IPZ， MNZ， MNZOH， DMZ， RNZ， IPZOH and HMMNI） in honey. The honey sample was extracted by H2O containing 0.1% formic acid solution. Then， the extraction solution was analyzed by TFUPLCMS/MS. The main factors influencing the purification efficiency including TF column， mobile phases and elution solutions were optimized. The compounds were detected by selective reaction monitoring （SRM） in positive ion mode electrospray ionization （ESI+）. The linear range of the method ranged from 0.1 to 50 μg/L for nitroimidazoles and their metabolites， with the correlation coefficient （R2） of over 0.997. The limits of quantification were 0.1 μg/kg for ornidazole， IPZ， 0.2 μg/kg for MNZ， MNZOH， DMZ， RNZ and IPZOH， and 1.0 μg/kg for HMMNI， respectively. The recoveries were in the range of 73.7% to 116.4% at four spiked levels with the relative standard deviations ranged from 1.1% to 9.1% in honey samples. The results indicate that the developed method is simple， efficient and precise， and can be used for the determination of nitroimidazoles and their metabolites in the actual honey samples.

Keywords TurboFlowultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Nitroimidazoles and metabolites； Honey

（Received 9 September 2014； accepted 10 October 2014）

21 GarcíaGaln M J， DíazCruz M S， Barceló D. Talanta， 2010， 81： 355-366

22 Fayad P B， Prévost M， Sauvé S. Talanta， 2013， 115： 349-360

23 Liu R Z， Ruan T， Wang T， Song S J， Guo F， Jiang G B. Talanta， 2014， 120： 158-160

Determination of Nitroimidazoles and Their Metabolites Residues in

Honey by TurboFlow Online PurificationUltra Performance Liquid

ChromatographyTandem Mass Sepctrometry

and Istopes Dilution Technique

ZHANG Lu*1， KONG XiangHong1， WANG Han1， LI JianHua， HE Qiang1， XU NiuSheng2

1（Shannxi EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Xi′an 710038， China）

2（Thermo Fisher Scientific （China）， Shanghai 201206， China）

Abstract A TurboFlow （TF） online purificationultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometric method was developed for the determination of nitroimidazoles and their metabolites （ornidazole， IPZ， MNZ， MNZOH， DMZ， RNZ， IPZOH and HMMNI） in honey. The honey sample was extracted by H2O containing 0.1% formic acid solution. Then， the extraction solution was analyzed by TFUPLCMS/MS. The main factors influencing the purification efficiency including TF column， mobile phases and elution solutions were optimized. The compounds were detected by selective reaction monitoring （SRM） in positive ion mode electrospray ionization （ESI+）. The linear range of the method ranged from 0.1 to 50 μg/L for nitroimidazoles and their metabolites， with the correlation coefficient （R2） of over 0.997. The limits of quantification were 0.1 μg/kg for ornidazole， IPZ， 0.2 μg/kg for MNZ， MNZOH， DMZ， RNZ and IPZOH， and 1.0 μg/kg for HMMNI， respectively. The recoveries were in the range of 73.7% to 116.4% at four spiked levels with the relative standard deviations ranged from 1.1% to 9.1% in honey samples. The results indicate that the developed method is simple， efficient and precise， and can be used for the determination of nitroimidazoles and their metabolites in the actual honey samples.

Keywords TurboFlowultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Nitroimidazoles and metabolites； Honey

（Received 9 September 2014； accepted 10 October 2014）