孟令帥，徐鑫，劉倩穎，宋雪飛，鄒婷婷，烏日娜

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

酸奶的后酸化是指酸奶在正常發(fā)酵結(jié)束后，在貯存、產(chǎn)品運(yùn)輸、銷售、食用前這一過(guò)程中，乳酸菌仍在生長(zhǎng)繁殖，并在β-半乳糖苷酶的催化下，繼續(xù)分解殘存的糖產(chǎn)生乳酸，使酸奶的酸度進(jìn)一步升高，以至于出現(xiàn)了消費(fèi)者不可接受的過(guò)酸味及感官質(zhì)量下降的現(xiàn)象［1-2］。

酸奶制品的后酸化問(wèn)題嚴(yán)重影響了消費(fèi)者對(duì)酸奶制品的接受性，嚴(yán)重影響了酸奶制品的普及和發(fā)展，為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開(kāi)了積極研究。

國(guó)內(nèi)對(duì)延長(zhǎng)酸奶保質(zhì)期的研究集中在添加穩(wěn)定劑、控制發(fā)酵菌種以及殺菌技術(shù)等方法上［3-4］。李海燕等人將乳酸鏈球菌素添加到酸奶中，可以有效抑制酸奶的后酸化問(wèn)題，延長(zhǎng)酸奶的保質(zhì)期［5］。

國(guó)外學(xué)者對(duì)酸奶的后酸化問(wèn)題是從乳酸菌細(xì)胞、基因的水平上進(jìn)行研究的，并已獲得后酸化弱的乳酸菌菌株。目前，對(duì)乳酸菌的乳糖代謝機(jī)理，細(xì)胞對(duì)H+調(diào)控，酶的基因調(diào)控進(jìn)行了研究，已取得了某些共識(shí)。對(duì)保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌此二菌株研究表明［6］，此二菌株對(duì)乳酸的代謝方式為同型乳酸發(fā)酵，乳糖經(jīng)透膜酶被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)半乳糖苷酶催化，產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成乳酸和能量;而半乳糖不被利用，被排除細(xì)胞外［7］。另外，現(xiàn)有研究己證實(shí)，乳酸菌在正常生長(zhǎng)條件下，菌體細(xì)胞內(nèi)pH值與周圍環(huán)境的pH值不同，菌體細(xì)胞有保持其細(xì)胞質(zhì)pH值在中性條件下的能力，以利于菌體在各種環(huán)境條件下維持正常的新陳代謝和各種酶反應(yīng)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)保質(zhì)期間的酸奶pH、酸度、酸乳的游離氨基氮質(zhì)量濃度和乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定，來(lái)分析酸奶在貨架期間各項(xiàng)指標(biāo)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品的準(zhǔn)備

購(gòu)買市售5 個(gè)品牌的酸奶，以1、2、3、4、5 進(jìn)行編號(hào)。各樣品的信息如表1所示。

表1 購(gòu)買的酸奶樣品Table 1 Yogurt samples purchased from supermarket

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋(SYQ-DSX-280A上海申安醫(yī)療器械廠)，電子天平(ALC-210北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，pH計(jì)(PHS-25上海日島科學(xué)儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6常州國(guó)華電器有限公司)，電熱干燥培養(yǎng)箱(HG-303南京實(shí)驗(yàn)儀器廠)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，低溫生化培養(yǎng)箱(SHP-1500型上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

(1)化學(xué)試劑:NaOH、甲醛、緩沖溶液、鄰苯二甲酸，均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

(2)培養(yǎng)基:MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸奶樣品的儲(chǔ)藏

取相同生產(chǎn)日期的產(chǎn)品各8杯，于4℃進(jìn)行儲(chǔ)藏，分別在第7、14、21、26天取樣進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 pH值的測(cè)定

1.2.2.1 酸度計(jì)的校正

首先，開(kāi)啟酸度計(jì)電源，預(yù)熱30 min。然后，分別用pH 6.86和pH 4.00的緩沖溶液進(jìn)行校準(zhǔn)［8］。

1.2.2.2 樣液pH值的測(cè)定

采用精密pH計(jì)(pHS-25，上海日島科學(xué)儀器有限公司)，對(duì)在冷藏環(huán)境中放置的第7天、第14天、第21天和第26天的5種酸奶的pH值進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 滴定酸度的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)定

精密稱取0.6 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)，在105～110℃干燥至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀，加50mL新煮沸過(guò)的冷蒸餾水，振搖使其溶解，加二滴酚酞指示劑，用配制的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微粉紅色30 s不退色。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.2.3.2 樣品滴定酸度的測(cè)定

(1)原理:以pH計(jì)指示pH 8.2為滴定終點(diǎn)，中和酸奶所消耗濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液的體積數(shù)(以mL計(jì))，來(lái)表示酸奶的滴定酸度值。

(2)方法:pH計(jì)每次使用前、后，用緩沖標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)。取樣液40 g，置于燒杯中用已標(biāo)定濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液滴定。用pH計(jì)指示滴定終點(diǎn)，終點(diǎn)pH值為8.2，讀取消耗的NaOH溶液的毫升數(shù)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

(3)計(jì)算公式

式中:V1為滴定消耗的堿液體積;V0為空白滴定消耗的堿液體積;c為堿液濃度(mol/L);m為樣品取用量。

1.2.4 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法，對(duì)在冷藏環(huán)境中放置的第7天、第14天、第21天和第26天的5種酸奶的乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定［9］，具體步驟如下:

(1)將MRS培養(yǎng)基121℃滅菌15 min后，放入恒溫50℃的水浴鍋中保溫。

(2)將滅菌后的無(wú)菌水、移液管、試管等全部放入超凈工作臺(tái)，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的通風(fēng)系統(tǒng)及紫外燈，殺菌20 min。

(3)用1mL的移液管取待測(cè)的酸奶樣品0.5 mL，放入含有4.5 mL無(wú)菌水試管中，混合均勻，即把樣品稀釋了10倍，依此方法作梯度稀釋直至10-7。

(4)分別取 10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度的樣品各0.5 mL于滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，倒入MRS培養(yǎng)基，輕輕搖勻，靜置凝固，每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行樣。

(5)將凝固后的培養(yǎng)基倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算后即得乳酸菌數(shù)。

1.2.5 游離氨基氮的測(cè)定

采用甲醛電位滴定法，對(duì)在冷藏環(huán)境中放置的第7天、第14天、第21天和第26天的5種酸奶的游離氨基氮進(jìn)行測(cè)定［10］。

1.2.5.1 甲醛電位滴定法的原理

加入甲醛溶液以固定氨基酸中—NH2的堿性，使—COOH的酸性顯示出來(lái)，將pH計(jì)的玻璃電極和甘汞電極插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定，依據(jù)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)［11］。

1.2.5.2 具體步驟

取樣液40.0 g置于燒杯中，用濃度為0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH值為8.2，加10 mL中性甲醛溶液并混勻，繼續(xù)使用濃度為0.05 mol/L的NaOH的標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH值為9.2。記錄消耗的堿液的體積V1;取40.0 g蒸餾水，做空白試驗(yàn)，消耗的堿液的體積V2。

1.2.5.3 計(jì)算公式

式中:X為樣液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度以N計(jì)g/100 mL;m為取用的樣液的質(zhì)量;V1為加人甲醛后滴定至終點(diǎn)(pH 9.2)所消耗的NaOH溶液體積;V2為空白實(shí)驗(yàn)加人甲醛后滴定至終點(diǎn)(pH 9.2)所消耗的NaOH溶液的體積。

1.2.6 感官評(píng)價(jià)

對(duì)在冷藏環(huán)境中放置的第7天、第14天、第21天和第26天的5種酸奶分別進(jìn)行感官評(píng)價(jià)［12］。采用百分制評(píng)分方法，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The senses score standard

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶貯存過(guò)程中pH值的變化及分析

試驗(yàn)對(duì)于5種酸奶在儲(chǔ)藏期間的pH值進(jìn)行了測(cè)定，如圖1所示。

圖1 5種酸奶樣品在儲(chǔ)藏期間pH值變化Fig.1 pH changes of five kinds of yogurt samples during storage

由圖1可知，5種酸奶的pH值均隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。樣品2與樣品5 pH下降幅度最大，樣品3下降幅度最小，在第7天時(shí)，5種樣品的pH值在4.07～4.32之間。經(jīng)過(guò)1周的儲(chǔ)存，樣品2和樣品3的pH值降低到低于4.0，分別為3.89，3.98。其他樣品都保持在4.0左右。在保質(zhì)期第21天時(shí)，只有樣品4和樣品5的pH保持在4.0左右，分別為4.0和3.99。超過(guò)保質(zhì)期第26天時(shí)，只有樣品4的pH值是3.99，接近4.0。pH值在儲(chǔ)藏期間不斷降低是乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果，其中第21天和第26天差異比較小，可能是由于乳酸菌活菌數(shù)減少，活力降低［13-14］。

2.2 酸奶貯存過(guò)程中酸度的變化及分析

表3為5種酸奶在儲(chǔ)藏期間滴定酸度的變化。

表3 冷藏下酸奶貯存過(guò)程中酸度測(cè)定結(jié)果Table 3 The measurement results of yogurt during storage in the refrigerator

由表3可知，5種酸奶的酸度值(°T)隨著貯存天數(shù)的增加而不斷升高，而且，酸度值基本與其pH值相對(duì)應(yīng)，pH值越高的其酸度值越低，而pH值越低的其酸度值越高［15］。樣品2、樣品5在儲(chǔ)藏期間酸度變化最大，這種現(xiàn)象就是工業(yè)上常見(jiàn)的酸奶后酸化現(xiàn)象。在貯存過(guò)程中，乳酸菌繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，菌體的生長(zhǎng)消耗掉殘存的糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致酸度進(jìn)一步升高，這也是酸奶pH值不斷下降的原因［16］。GB19302-2010中規(guī)定酸奶制品的°T≥70，5種樣品在保質(zhì)期內(nèi)，酸度均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 酸奶貯存期間乳酸菌活菌數(shù)的變化及分析

酸奶在4℃貯藏過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)如表4所示。

表4 冷藏下酸奶貯存過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定(log CFU/g)Table 4 Determination of the number of yogurt viable cells during storage in the refrigerator(log CFU/g)

由表4可知，酸乳在整個(gè)貨架期間，隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)［17-19］，在7～21 d內(nèi)，乳酸菌活菌數(shù)下降速度較快。但都符合GB19302-2010中1×106CFU/mL的要求。在第7天時(shí)，5種樣品的乳酸菌的活菌數(shù)在(3.3×107～7.7×107)CFU/mL。經(jīng)過(guò)1周的儲(chǔ)存，樣品1和樣品5乳酸菌活菌數(shù)較多，分別為2.15×107和1.075×107CFU/mL。在保質(zhì)期內(nèi)，雖然所有樣品的乳酸菌活菌數(shù)都符合標(biāo)準(zhǔn)，但是在過(guò)保質(zhì)期后第26天，樣品2還能保持較多活菌，與其它樣品不同，嗜酸乳桿菌是其發(fā)酵菌種，可能是因?yàn)樵趐H值較低的情況下，乳酸菌的耐酸性比較強(qiáng)，從而導(dǎo)致過(guò)保質(zhì)期存活的活菌數(shù)較多。

2.4 游離氨基氮質(zhì)量濃度變化規(guī)律

試驗(yàn)檢測(cè)了酸奶在4℃貯藏過(guò)程中游離氨基氮質(zhì)量濃度的變化，如圖2所示。

圖2 冷藏下酸奶貯存過(guò)程中游離氨基氮的變化Fig.2 Changes of free amino nitrogen from yogurt during storage in the refrigerator

由圖2可知，第7天到第14天，酸奶的游離氨基氮質(zhì)量濃度在冷藏初期均有較小幅度的上升，之后隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢降低。游離氨基氮的質(zhì)量濃度在冷藏初期的上升可以說(shuō)明乳酸菌的代謝活動(dòng)仍然在進(jìn)行，但是增加的幅度很小，說(shuō)明冷藏條件下抑制了乳酸菌的代謝活性。在貨架期的后期游離氨基氮的質(zhì)量濃度下降，這可能是由乳酸菌受溫度的影響，蛋白代謝活性受到了很大抑制，氨基酸的生成減緩。另一方面，乳酸菌的代謝活動(dòng)仍在進(jìn)行，對(duì)氨基酸有一定消耗。當(dāng)氨基酸的生成速度低于消耗速度時(shí)導(dǎo)致游離氨基氮質(zhì)量濃度下降［20-21］。

在冷藏期間內(nèi)，樣品1的游離氨基氮質(zhì)量濃度變化不是很明顯，其余3種攪拌型酸乳的游離氨基氮質(zhì)量濃度在冷藏初期7～14 d都有較小幅度的上升，從保質(zhì)期的第14天開(kāi)始，隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢降低。而凝固型樣品3與其他攪拌型樣品不同，在保質(zhì)期內(nèi)其質(zhì)量濃度一直增加，在過(guò)保質(zhì)期后才下降?？赡芤?yàn)樵诶洳貤l件下乳酸菌的代謝活動(dòng)仍然在進(jìn)行，乳酸菌的代謝活性受到抑制，但凝固型的乳酸菌的代謝活性受到抑制較小。后期氨基酸的生成速度低于消耗速度導(dǎo)致游離氨基氮質(zhì)量濃度下降。

2.5 感官評(píng)價(jià)

采用加權(quán)評(píng)分法對(duì)5種樣品酸奶在儲(chǔ)藏期間的感官質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)定，檢驗(yàn)人數(shù)為10人，檢驗(yàn)結(jié)果取平均值，樣品3感官評(píng)分一直保持90分，只有在過(guò)保質(zhì)期才有所下降，是5種樣品中品質(zhì)最好的。

表5 采用百分制評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 The result by using percentile evaluation results

由表5可知，通過(guò)感官評(píng)定可以進(jìn)一步證實(shí)，酸奶制品在貯存過(guò)程中整體質(zhì)量下降，樣品1、4和5最為明顯。酸度的下降可以帶來(lái)乳清析出、活菌數(shù)減少等一系列變化。另一方面，樣品發(fā)酵所用的菌種不同，也可能是導(dǎo)致口感不同的主要原因之一。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)5種市售酸奶在冷藏條件下貯存的研究顯示，5種酸奶在保質(zhì)期內(nèi)，pH值、酸度、乳酸菌活菌數(shù)等質(zhì)量指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19302-2010的要求。過(guò)保質(zhì)期后，酸奶的pH值繼續(xù)降低，酸度升高，乳酸菌活菌數(shù)繼續(xù)減少，酸奶的整體質(zhì)量，包括酸奶的口感和風(fēng)味都有很大程度的降低。

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