徐沙，劉立明

1(江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過程中，為了維持發(fā)酵體系的pH始終處于最適范圍，需要流加NaOH等堿性物質(zhì)。隨著NaOH等中和劑的不斷添加，發(fā)酵體系滲透壓不斷升高，導(dǎo)致細胞活力和丙酮酸積累能力的顯著下降，最終影響丙酮酸生產(chǎn)效率。前期研究表明，在利用T.glabrata發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的過程中，當(dāng)發(fā)酵液中丙酮酸濃度大于45 g/L時，丙酮酸合成能力受到顯著限制，高滲透壓的抑制作用在此時成為進一步優(yōu)化發(fā)酵過程的關(guān)鍵限制因素［1］。

微生物在遭受環(huán)境刺激時，往往會伴隨著蛋白質(zhì)組表達水平的變化［2］。如Gori等在研究漢遜酵母鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)組的變化情況時發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下被誘導(dǎo)表達的蛋白主要是甘油合成/異化途徑和糖酵解途徑上游酶系;而被抑制表達的蛋白主要是糖酵解途徑的下游、三羧酸途徑和氨基酸合成途徑中的酶［3］。利用二維電泳和同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)，可以同時分析數(shù)以百計的蛋白質(zhì)，從系統(tǒng)水平研究微生物在蛋白質(zhì)表達層面響應(yīng)脅迫的機制［4］。本研究以具有工業(yè)應(yīng)用價值的T.glabrata為研究模型，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和技術(shù)，從應(yīng)用基礎(chǔ)方面，探索T.glabrata抵御高滲透壓脅迫的機理。在此基礎(chǔ)上，如能根據(jù)所獲得的生理機制，采用適當(dāng)?shù)氖侄螐娀疶.glabrata在高滲透壓脅迫條件下的生理功能，可以最終可以達到提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度的目的。這一研究結(jié)果可應(yīng)用于有機酸發(fā)酵及其他典型工業(yè)生物過程中，為工業(yè)生物技術(shù)，特別是發(fā)酵過程優(yōu)化提供新的技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

T.glabrata CCTCC M202019，是 NA-、Bio-、B6-和Bio-營養(yǎng)缺陷型，由本研究室自行篩選并保藏［5］。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)

葡萄糖 100 g，NH4Cl 7 g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 0.8 g，乙酸鈉6 g，煙酸4 mg，鹽酸硫胺素30 μg，煙酸吡哆醇 100 μg，生物素10 μg，核黃素50 μg，CaCO340 g(搖瓶培養(yǎng)時調(diào)節(jié)pH用)。添加NaCl改變發(fā)酵培養(yǎng)基滲透壓，0、30、50、80 g/L NaCl對應(yīng)的溶液滲透壓分別為 860，1 765，2 603和 3 324 mOsmol/kg。培養(yǎng)基初始pH 5.5。維生素液過濾除菌后加入。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

從新鮮斜面上接1環(huán)菌入種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，于30℃、200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h后，以10%接種量(v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵:500 mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為50 mL，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時間為48 h。

1.3 試劑

ReadyPrepTMProtein extraction kit，ReadyPrep 2-D clean up kit，ReadyPrep 2-D Starter kit，RC DC Protein Assay Kit I(bovine IgG standard)，17 cm/pH4 ～7 預(yù)制膠條，覆蓋瓊脂糖溶液，礦物油均購自Bio-Rad(上海)公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，蛋白酶抑制劑Cocktail購自Roche公司，其余化學(xué)藥劑均購自上海生工。

1.4 二維電泳

1.4.1 樣品制備

取培養(yǎng)至對數(shù)生長中期的細胞，發(fā)酵液離心(4 ℃，10 000×g，1 min)，除去上清，用超純水洗滌3次。取出 ReadyPrepTMProtein extraction kit，取 1 mL 2-D Rehydration/Sample Buffer 并加入 10 μL TBP、0.2%兩性電解質(zhì)和20 μL蛋白酶抑制劑，漩渦混勻器混勻，再加入50 μL濕菌體。將混合后的樣品置于冰上，用超聲波破碎儀進行細胞破碎，方法為:每破碎30 s停10 s，共破碎30 min。離心(4 ℃，16 000×g，30 min)，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。樣品可直接用于上樣至IPG膠條，或者-80℃保藏待用。

1.4.2 總蛋白定量

采用RC DC Protein Assay Kit I(Bovine IgG standard)進行總蛋白定量。

1.4.3 等電聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳

(1)取出低溫保存的樣品溶液和17 cm IPG膠條，室溫放置10 min。

(2)沿聚焦盤中槽邊緣由左至右，線性加入樣品，保證中間樣品液連貫且無氣泡。

(3)去除IPG膠條上的保護層，將IPG膠條膠面朝下置于樣品液上，膠條正極對應(yīng)聚焦盤正極并與電極緊密接觸，膠條下面溶液保證無氣泡。

(4)每根膠條上覆蓋約1.5 mL礦物油，對好正、負極，蓋上蓋子，將聚焦槽水平放置于等電聚焦儀中，設(shè)置等電聚焦程序。

(5)等電聚焦程序:

選擇所放置的膠條數(shù)，設(shè)置膠條極限電流(50 μA/根)和等電聚焦時的溫度(20℃)。

(6)聚焦結(jié)束后，將膠條置于水化盤中，立即采用ReadyPrep2-D Starter kit中的平衡液平衡15 min。

(7)將膠條轉(zhuǎn)移至15%聚丙烯酰胺凝膠，電泳程序為:2 w/gel 1 h，16 w/gel 4 h。

(8)電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進行染色。

1.4.4 圖像采集及蛋白點差異分析

將經(jīng)過染色的凝膠用Image Scanner III Image Scanner III(GE美國)掃描儀掃描成像之后，應(yīng)用PDQuest 8.0.1(Bio-Rad)軟件進行圖像分析。

1.5 基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

(1)提取對數(shù)生長中期的細胞全蛋白并定量。

(2)蛋白定量后，各取相同量(50～100 μg)的蛋白(體積不大于25 μL，少于25 μL的用專用裂解液補至25 μL)進行還原化和烷基化。

(3)按樣品50∶1加胰蛋白酶，37℃放置12～16 h。

(4)加入相應(yīng)的同位素標(biāo)記試劑(114、115、116和117，標(biāo)記試劑為 ABI公司的 iTRAQ標(biāo)記試劑盒)，室溫放置1 h。

(5)加入10 μL 1 mol/L的乙醇胺進行終止，室溫放置30 min。

(6)各取相同的體積的樣品混合后進行HPLC分離(4個梯度)，自動點板器點板。

(7)將帶有樣品的靶板加基質(zhì)后進行HPLC-質(zhì)譜鑒定，HPLC為日本島津公司的2D-nano-HPLC，質(zhì)譜為美國ABI公司的MALDI-TOF-TOF 4700。

(8)搜索數(shù)據(jù)庫，得出峰對應(yīng)的蛋白質(zhì)，并進一步獲得相對定量結(jié)果。

兩樣本的比值在0.9～1.1之間的，可以認為兩樣本的含量是一樣的(對于本次實驗而言，每次實驗這個值會略有不同)，而小于0.9或大于1.1均可認為兩樣本之間的比值存在差異。

1.6 滲透壓測定

發(fā)酵液滲透壓采用OSMOMAT 030冰點滲透壓儀測定(OSMOMAT 030，Gonotech GmbH，Berlin，Germany)。

2 實驗結(jié)果

2.1 光滑球擬酵母蛋白質(zhì)組概況

為了對T.glabrata鹽脅迫前后蛋白表達具有更加全面的認識，進行了針對細胞胞內(nèi)全蛋白分布的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。在pI值為4～7的膠條上，T.glabrata的蛋白質(zhì)點主要分布在pI值為5～7，分子量主要分布在30 k～100 kDa的范圍內(nèi)(圖1A)，說明 T.glabrata的蛋白多偏堿性，小分子量的蛋白質(zhì)含量較少。不同滲透壓脅迫條件下T.glabrata蛋白質(zhì)組差異比較如圖1所示。

圖1 不同滲透壓條件下光滑球擬酵母蛋白質(zhì)組的變化Fig.1 Total proteome of T.glabrata on the gel with pH of 4～7

采用PDQuest 8.0軟件進行圖像分析和數(shù)據(jù)采集，在培養(yǎng)基滲透壓分別為 860 mOsmol/kg、1765 mOsmol/kg、2603 mOsmol/kg和 3324 mOsmol/kg時，T.glabrata的蛋白點分別鑒定出891、869、822和805個，匹配率分別為98%、98%、100%和96%，說明蛋白質(zhì)種類隨滲透壓變化影響不大。比較滲透壓為3324 mOsmol/kg的條件與正常條件(860 mOsmol/kg)時蛋白質(zhì)組差異表明，含量提高2倍的蛋白點有37個，其中含量提高3倍的蛋白點20個，另外含量下降2倍以上的點為35個。

為了更深入透徹地研究不同滲透壓條件下T.glabrata蛋白質(zhì)組的變化，采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)進行進一步分析。iTRAQ技術(shù)是一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)(下文中的得到所有結(jié)果均基于這項技術(shù))。在不同滲透壓脅迫條件下，T.glabrata的相對蛋白含量(即高滲脅迫與正常培養(yǎng)條件下蛋白含量之比)，兩樣本的比值如果在0.9～1.1之間的，可以認為兩樣本的含量是一樣的，即比值為1∶1;而小于0.9或大于1.1均可認為兩樣本之間的比值是有差異的。iTRAQ技術(shù)檢測到589個蛋白，絕大多數(shù)都功能已知。在滲透壓為1765 mOsmol/kg、2603 mOsmol/kg和 3324 mOsmol/kg時，相對于對照條件(860 mOsmol/kg)，分別有125、91和109個蛋白表達水平上調(diào);94、89和78個蛋白表達水平下調(diào)。

2.2 中心代謝途徑的差異蛋白分析

如表1所示，中心代謝途徑中表達量發(fā)生上調(diào)的蛋白有8個。其中6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(CAGL0H05445g)、果糖二磷酸醛縮酶(CAGL0L02497g)、檸檬酸合酶(CAGL0H03993g)和 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(CAGL0M13343g)只在較低的高滲條件下蛋白表達量提高;而異檸檬酸脫氫酶(CAGL0I07227g)和轉(zhuǎn)酮醇酶(CAGL0D01298g)在3個不同的高滲條件下表達水平均有提高。己糖激酶(CAGL0F00605g)的表達水平受到一定程度的抑制。整體而言，相比正常條件，高滲環(huán)境下的酵母細胞中心代謝途徑略有上調(diào)，其中多數(shù)蛋白的表達水平只在滲透壓相對較低的條件下(1765 mOsmol/kg)有所提高，滲透壓對中心代謝途徑的蛋白質(zhì)表達水平影響不大。

表1 中心代謝途徑的差異表達蛋白Table 1 Differential expression proteins in central metabolic pathways

2.3 能量代謝途徑的差異蛋白分析

檢測到的中心代謝途徑中與能量代謝相關(guān)的差異表達蛋白有6-磷酸果糖激酶(CAGL0F08041g)、丙酮酸激酶(CAGL0E05610g)、異檸檬酸脫氫酶(CAGL0I07227g)和己糖激酶(CAGL0F00605g)，前三者蛋白表達水平上調(diào)，而后者的表達受到一定程度的抑制。

氧化磷酸化途徑中的蛋白表達如表2所示，共檢測到8個蛋白或亞基。除復(fù)合物II以外(未檢測到相關(guān)蛋白或亞基)，復(fù)合體Ⅲ、Ⅴ的表達水平特別是復(fù)合體V有明顯上調(diào);而復(fù)合體I的表達可能略有下調(diào)。其中H+轉(zhuǎn)運ATP酶(CAGL0A00495g)的蛋白表達水平上調(diào)幅度在1.2倍以上，有明顯提高。

表2 高滲條件對能量代謝途徑蛋白質(zhì)表達的影響Table 2 Osmotic-regulated proteins in energy metabolism pathway

2.4 其他代謝途徑的差異蛋白分析

如表3所示，在滲透壓為1765 mOsmol/kg、2603 mOsmol/kg和3324 mOsmol/kg的條件下尿素羧化酶(CAGL0M05533g)的蛋白表達水平分別為正常條件下(860 mOsmol/kg)的0.72、0.74和0.74倍，有明顯下降。與液泡相關(guān)的蛋白如CAGL0M00352g、CAGL0G01342g、CAGL0K04807g和 CAGL0M00616g等表達水平有一定程度的提高，可能與高滲條件下相容性溶質(zhì)在胞質(zhì)和液泡中的分布情況有關(guān)。液泡Ca2+通道蛋白(CAGL0J08613g)介導(dǎo)高滲脅迫下的液泡Ca2+釋放，但研究表明該蛋白的表達水平?jīng)]有發(fā)生變化，說明它可能并不依靠濃度的增加而是通過提高蛋白活性，來降低高滲脅迫對細胞的影響。此外，超氧化物歧化酶(CAGL0C04741g)和富脯蛋白(CAGL0G00968g)的表達水平也有明顯提高。

表3 高滲條件對其他蛋白質(zhì)表達的影響Table 3 Other osmotic-regulated proteins

3 討論

盡管有部分蛋白未檢出，但作者通過對中心代謝途徑、能量代謝途徑、其他途徑等分析仍然得到了一些有用的結(jié)果。對中心代謝和能量代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)，在高滲條件下，與能量相關(guān)的蛋白表達量有一定程度的提高，尤其是那些參與產(chǎn)生ATP或形成NADH的基因。高滲脅迫條件下，細胞產(chǎn)生更多的能量，可以用于合成相容性溶質(zhì)或激活其他抗脅迫途徑，抵抗高滲脅迫對細胞的負面作用。上述研究結(jié)果和Schmidt等關(guān)于pH脅迫對T.glabrata蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果類似。Schmidt等發(fā)現(xiàn)在pH為4.0的條件下，葡萄糖分解酶(Glk1p、Fba1p、Pgi1p、Cdc19p/Pyk1p、Pdc1p、Tdh3p和Tkl1p)和三羧酸循環(huán)途徑中的酶(Aco1p、Lsc2p和 Mdh1p)表達水平都發(fā)生上調(diào)［6］。

多數(shù)生物依靠積累甘油作為相容性溶質(zhì)抵御滲透壓脅迫［7］。如Hirasawa等通過研究釀酒酵母在高滲脅迫條件下胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的變化情況，發(fā)現(xiàn)脅迫誘導(dǎo)3-磷酸甘油脫氫酶(Hor2p)表達量提高并伴隨著甘油的積累［8］。但在本研究中，當(dāng)發(fā)酵液滲透壓分別為 1765 mOsmol/kg、1765 mOsmol/kg和 3324 mOsmol/kg時，3-磷酸甘油脫氫酶(CAGL0C05137g)的蛋白表達量與正常條件(860 mOsmol/kg)之比分別為1.05、1.02和1.02，沒有發(fā)生上調(diào)。前期轉(zhuǎn)錄組研究也表明，高滲脅迫對HOG-MAPK途徑的影響不大。因此作者認為，與釀酒酵母不同，T.glabrata可能并不存在積累甘油作為相容性溶質(zhì)，平衡胞內(nèi)外滲透壓，抵御高滲脅迫的機制。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(CAGL0C04741g)和富脯蛋白(CAGL0G00968g)的表達量大幅度提高。作者前期研究表明，高NaCl濃度會增加胞內(nèi)的活性氧(ROS)濃度［9］，超氧化物歧化酶的表達量提高可能起到減輕ROS對細胞的損傷作用。而富脯蛋白是一種含磷蛋白，其主要特點是氨基酸組成中脯氨酸含量特別高占25%～40%以上。高滲環(huán)境下，富脯蛋白表達量提高可能與T.glabrata胞內(nèi)的脯氨酸的積累有一定關(guān)系［10］。因此，下一步作者將考慮添加脯氨酸或者在胞內(nèi)過量表達脯氨酸作為相容性溶質(zhì)，達到進一步提高T.glabrata抗高滲脅迫能力的目的。

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