茍銳鋒，柴沙駝，高丹，王樹林，，*

（1.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧810016；2.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

β-胡蘿卜素（β-C）是存在于植物體內(nèi)的脂溶性維生素，人與動物都無法合成。β-胡蘿卜素在動物體內(nèi)是維生素 A（VA）的主要來源[1-3]，VA及其衍生物（視黃酸和視黃醛）不僅可維持動物和人的正常視力[4]，且在細胞分化、發(fā)育和增殖等方面起重要作用，但動物和人的機體不能合成VA，只能直接通過VA制劑或間接通過食物中的類胡蘿卜素降解而獲得。

一般動物組織對β-胡蘿卜素在內(nèi)的類胡蘿卜素的富集并不十分明顯，正常的動物組織并不表現(xiàn)出黃色，但有些動物的脂肪及其他組織表現(xiàn)出明顯的類胡蘿卜素富集能力，許多品種的家禽脂肪具有明顯的黃色，在禽類肉品質(zhì)評價中這種特點并不是一種缺陷。許多水生動物的組織具有類胡蘿卜素的富集能力，例如許多觀賞魚類具有的鮮艷顏色與類胡蘿卜素在肌肉及其他組織中的富集有關(guān)[5]。動物各組織在富集β-胡蘿卜素存在差異，肝臟是主要的β-胡蘿卜素富集和代謝組織，此外，性別也會影響組織對β-胡蘿卜素的吸收，例如，ReynosoCR等研究表明，母牛脂肪組織中β-胡蘿卜素的含量（42μg/100g）遠高于公牛（26μg/100g）[6]。大多數(shù)家畜的肌肉和脂肪對類胡蘿卜素并沒有明顯的富集能力，這是大多數(shù)家畜的脂肪表現(xiàn)為白色的原因，也是正常家畜肉品質(zhì)所必須具有的特征，在非正常情況下（例如遺傳缺陷及病理原因）家畜脂肪的黃色被認為是一種品質(zhì)缺陷，這種現(xiàn)象并不十分普遍。但牦牛肉的脂肪具有明顯的黃色，且這種黃色隨季節(jié)及營養(yǎng)變化而發(fā)生改變，在牦牛肉品質(zhì)評價中這種特點不能簡單地定義為是一種缺陷。牦牛脂肪的黃色與牦牛脂肪高效富集類胡蘿卜素化合物直接相關(guān)，但關(guān)于牦牛組織富集類胡蘿卜素的機理及其對維生素代謝的影響缺乏研究。

牦牛組織中類胡蘿卜素含量的測定是開展以上研究的基礎。測定動物組織的β-胡蘿卜素，首先要對組織中的β-胡蘿卜素要進行提取，提取工藝是否合理，溶劑選擇是否恰當，直接關(guān)系到測定結(jié)果。常用的提取方法有：有機溶劑提取法、酶反應法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[7]。β-胡蘿卜素的測定方法一般是用有機溶劑將β-胡蘿卜素提取到有機相，脂肪含量大的樣品進行皂化，再萃取其不皂化物，經(jīng)過柱層析或紙層析將β-胡蘿卜素分離，分光光度法定量，或用高效液相色譜法分離定量[1]。

目前鮮見對牦牛組織中類胡蘿卜素系統(tǒng)測定的研究報道，本試驗中采用氨水皂化，石油醚為溶劑對牦牛肉及脂肪β-胡蘿卜素進行萃取，利用正交試驗優(yōu)化提取工藝，以期為牦牛組織中類胡蘿卜素的代謝機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：牦牛肌肉，牦牛脂肪。

試劑：濃氨水（25%～28%）、乙醇（99.7%）、石油醚：天津市富宇精細化工有限公司；β-胡蘿卜素標準品（99.5%，F(xiàn)luka公司）均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2600島津紫外可見分光光度計：島津制作所；JM-B2003電子天平：余姚紀銘稱重校驗設備有限公司；THZ-82恒溫振蕩器：國華企業(yè)；800型離心沉淀器：上海手術(shù)機械十廠；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛肉及脂肪中β-胡蘿卜素的提取工藝流程

稱取5 g樣品，加入一定量石英砂進行研磨，使組織得到充分破碎，分別加氨水5 mL，乙醇35 mL，搖勻，在40℃下皂化60 min，取出后進行過濾棄去濾液得非皂化物[1]。按料液比為1∶15（g/mL）將非皂化物用75 mL的石油醚在50℃下浸提120 min，過濾得提取液，抽濾得樣品備用。工藝流程如圖1所示。

圖1 牦牛組織中β-胡蘿卜素提取工藝流程圖Fig.1 The process diagram of β-carotene extracting in yak tissues

1.3.2 β-胡蘿卜素含量測定方法

β-胡蘿卜素標準品的全波長掃描圖如圖2所示。

圖2 β-胡蘿卜素標準品的全波長掃描圖Fig.2 The full wavelength scanning diagram of β-carotene standard

β-胡蘿卜素在428、450、478 nm處具有特征吸收峰，450 nm處為最大吸收峰，因此以450 nm作為樣品檢測波長[8]。將提取物用石油醚定容到50 mL的容量瓶，用石油醚作參比，在450 nm處測吸光度值[9-10]。

1.3.3 β-胡蘿卜素標準曲線及組織中β-胡蘿卜素含量的計算

精確稱取β-胡蘿卜素標準品5 mg，用石油醚定容至50mL，其濃度為0.1mg/mL。取5個試管，分別取3、6、9、12、15 mL 標準品母液并定容到 50 mL，在 450 nm處測定吸收峰值并繪制出標準曲線，標準曲線如圖3所示。標準曲線方程為y=3. 2833x+0. 0185（R2=0. 9912）。

在450 nm處測定樣品吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品溶液中β-胡蘿卜素的濃度，按以下公式計算樣品中β-胡蘿卜素的表觀含量[11]。

式中：c為樣品提取物定容后β-胡蘿卜素的濃度，（mg/mL）；v為樣品提取物定容的體積，mL；m 為稱取樣品的質(zhì)量，g。

圖3 β-胡蘿卜素標準曲線Fig.3 The standard curve of β-carotene

1.3.4 皂化條件的單因素試驗設計

研究皂化溫度及時間對提取效果的影響。

1.3.4.1 不同皂化溫度的影響

分別在 30、40、50、60 ℃溫度下皂化 1 h，然后將非皂化物按1∶15的料液比在50℃下萃取2 h，過濾，濃縮，定容到50 mL的容量瓶，在450 nm處測吸光度值。

1.3.4.2 不同皂化時間的影響

在40℃分別皂化0.5、1、1.5 h，然后將非皂化物按1∶15（g/mL）的料液比在 50 ℃下萃取 2 h，過濾、濃縮、定容到50 mL的容量瓶，在450 nm處測吸光度值。

1.3.5 牦牛肉及脂肪β-胡蘿卜素萃取的正交試驗設計

β-胡蘿卜素萃取的正交試驗選擇萃取溫度、萃取時間、料液比3個因素，每個因素3個水平[12-13]，因素水平見表1。以β-胡蘿卜素提取液的吸光度值和提取率為考察指標，用L9（34）正交表安排試驗。

表1 β-胡蘿卜素萃取的正交試驗因素-水平表Table 1 The orthogonal experiment factors-levels table of βcarotene extracting

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果及分析

2.1.1 皂化溫度對提取效果的影響

β-胡蘿卜素為脂溶性維生素，對于脂肪含量高的樣品需對其進行皂化[14]，因為當脂肪含量較高時β-胡蘿卜素大部分溶解在脂肪中，進行萃取時，β-胡蘿卜素很難進入萃取液，影響試驗結(jié)果。而進行皂化可以使脂肪水解為游離的脂肪酸使β-胡蘿卜素釋放出來，提高萃取率[10]。皂化溫度對提取效果的影響如圖4所示。

圖4 皂化溫度對β-胡蘿卜素提取效果的影響Fig.4 Effect of saponification temperature on extracting of βcarotene

由圖4可知，在其他條件一定時，隨著皂化溫度的增加，樣品表觀含量增加，當皂化溫度為40℃時，測得的含量最高。繼續(xù)增加皂化溫度，提取效果反而變差，造成提取效果變差的原因可能是β-胡蘿卜素對熱不穩(wěn)定，隨著溫度升高部分β-胡蘿卜素分解[10]。故選擇最適的皂化溫度為40℃。

2.1.2 皂化時間對提取效果的影響

皂化時間對提取效果的影響如圖5所示。

圖5 皂化時間對β-胡蘿卜素提取效果的影響Fig.5 Effect of saponification time on extracting of β-carotene

由圖5可知，在其他條件一定時，隨著皂化時間的延長，提取率逐漸增加，在皂化時間為1 h時，提取率最高。皂化時間超過1 h，隨著皂化時間增加，提取率反而下降。這是因為皂化時間過短，皂化不完全，不能將全部脂肪水解為游離的脂肪酸，時間太長，部分β-胡蘿卜素會溶解在皂化系統(tǒng)溶液里[10]，故選擇最適的皂化時間為1 h。

2.2 正交試驗結(jié)果及分析

2.2.1 萃取牦牛脂肪β-胡蘿卜素正交試驗結(jié)果

牦牛脂肪中β-胡蘿卜素萃取條件的正交試驗結(jié)果及極差分析結(jié)果見表2。

由表 2 可見，料液比的平均值 k2＞k3＞k1，萃取溫度平均值 k3＞k2＞k1，萃取時間平均值 k2＞k3＞k1。因此最佳萃取組合為 A2B3C2，即料液比為 1∶15（g/mL），萃取溫度為60℃，萃取時間為1.5 h。料液比、萃取溫度、萃取時間3個因素的極差分別為10.60、7.10、6.05。表明料液比對β-胡蘿卜素提取效果影響最大，各因素對β-胡蘿卜素提取效果影響的主次為：料液比＞萃取溫度＞萃取時間。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 2 Results of orthogonal experiment and analysis

2.2.2 萃取牦牛肉β-胡蘿卜素正交試驗

牦牛肉中β-胡蘿卜素萃取條件的正交試驗結(jié)果及極差分析結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 3 Results of orthogonal experiment and analysis

由表 3 可知，料液比平均值 k2＞k1＞k3，萃取溫度平均值 k3＞k2＞k1，萃取時間平均值 k1＞k3＞k2。因此最佳萃取組合為 A2B3C1，即料液比為 1∶15（g/mL），萃取溫度為60℃，萃取時間為1 h。料液比﹑萃取溫度、萃取時間3個因素的極差分別為0.54、1.24、1.16。表明萃取溫度對牦牛肉β-胡蘿卜素提取效果影響最大，各因素對β-胡蘿卜素提取效果影響的主次為：萃取溫度＞萃取時間＞料液比。

2.2.3 驗證試驗及樣品測定結(jié)果

根據(jù)表2確定的最優(yōu)組合A2B3C2，在該條件下測得牦牛脂肪中β-胡蘿卜素含量為29.05 mg/100 g，其含量小于表2中的5號試驗30.53 mg/100 g，故綜合考慮得牦牛脂肪中β-胡蘿卜素萃取的最佳條件為A2B2C3，即料液比為 1∶15（g/mL），萃取溫度為 50 ℃，萃取時間為2 h，并且在該條件下進行驗證試驗得到牦牛脂肪中β-胡蘿卜素的含量為30.60 mg/100 g。

根據(jù)表3得到的最優(yōu)組合A2B3C1，即表3的6號試驗，在該條件下測得其牦牛肉中β-胡蘿卜素的含量為5.61 mg/100 g，在該條件下進行驗證試驗得到牦牛肉中β-胡蘿卜素的含量為5.70 mg/100 g。故牦牛肉中β-胡蘿卜素萃取的最佳條件為A2B3C1，即料液比為1∶15（g/mL），萃取溫度為 60 ℃，萃取時間為 1 h，牦牛肉中的含量為5.70 mg/100 g。

肉牛脂肪內(nèi)β-胡蘿卜素的濃度為0.99 μg/g，肌肉內(nèi)β-胡蘿卜素的濃度為0.16 μg/g[6]。由此可見牦牛無論脂肪或者肌肉其β-胡蘿卜素的含量均高于一般牛肉。

3 結(jié)論

通過正交試驗優(yōu)化了牦牛肉及脂肪中β-胡蘿卜素的提取工藝。牦牛脂肪中β-胡蘿卜素提取最佳工藝條件為：在 40 ℃下皂化 1 h，料液比為 1∶15（g/mL），萃取溫度為50℃，萃取時間為2 h。牦牛肉中的β-胡蘿卜素提取最佳工藝條件為：料液比為1∶15（g/mL），萃取溫度為60℃，萃取時間為1 h；試驗結(jié)果表明，牦牛的不同部位所含β-胡蘿卜素的量不同，牦牛脂肪中β-胡蘿卜素的含量為30.60 mg/100 g，牦牛肉中β-胡蘿卜素的含量為5.70 mg/100 g；試驗結(jié)果表明，牦牛組織中β-胡蘿卜素的含量遠高于一般牛脂肪。

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