刁文琦 吳銳 宋延君 李水秀 呂霞琳 王露霞 劉維達 張宏

以棋盤法測定漢防己甲素聯(lián)合伏立康唑的體外抗煙曲霉活性

刁文琦 吳銳 宋延君 李水秀 呂霞琳 王露霞 劉維達 張宏

目的探討漢防己甲素對伏立康唑抗煙曲霉的體外增效活性。方法參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的M38-A2方案，采用棋盤式微量液基稀釋法測定漢防己甲素聯(lián)合伏立康唑對21株煙曲霉臨床株的抗真菌活性，以吸光度A值測定法判讀最低抑菌濃度，并以FICI法評價聯(lián)合用藥的效果，同時以其中的CMCC(F)A.1a株為代表，用等效線圖解法驗證結果。結果漢防己甲素與伏立康唑單獨作用于上述煙曲霉臨床株的最低抑菌濃度分別為512 μg/ml和0.125～2 μg/ml，聯(lián)合用藥時的最低抑菌濃度值分別降至 8 ～ 128 μg/ml和 0.03 ～ 0.5 μg/ml，且終點清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失，F(xiàn)ICI值為 0.13 ～ 0.63，有 16 株菌表現(xiàn)為協(xié)同作用，其余菌株表現(xiàn)為無關作用。CMCC株相應的MIC值等效曲線是凹形，也表明具有協(xié)同作用。結論漢防己甲素對伏立康唑抗煙曲霉有體外增效活性。

粉防己堿；伏立康唑；煙曲霉；增效作用；棋盤法

近年來，由于血液系統(tǒng)腫瘤、艾滋病及器官移植患者的增加，深部真菌病的發(fā)病率及病死率也隨之升高[1]。其中由煙曲霉感染引起的侵襲性曲霉病的病死率可高達80%[2]。盡管兩性霉素B、三唑類及棘白菌素類等藥物使曲霉病患者生存率得到顯著改善，但隨著在臨床上的廣泛應用，其耐藥率逐漸增加，致使侵襲性曲霉病的治療已成為臨床上的棘手問題[1]。有文獻報道，抗真菌藥物的聯(lián)合應用可能對于一些侵襲性曲霉病的治療具有協(xié)同作用[2]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，天然藥用植物漢防己根的雙芐基異喹啉類化合物漢防己甲素(tetrandrine，TET)對氟康唑或酮康唑抗白念珠菌、聯(lián)苯芐唑或益康唑抗毛癬菌屬活性有增效作用，其主要機制可能與抑制藥物外排泵相關基因的表達有關[3-7]。為研究TET對唑類藥物抗煙曲霉是否也具有增效活性，本實驗采用棋盤式微量液基稀釋法(簡稱棋盤法)測定TET與伏立康唑(voriconazole，VRC)聯(lián)合作用于21株煙曲霉臨床株的體外抗真菌活性，以吸光度A值測定法判讀最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并以分數抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI) 法及其等效線圖解法評價并驗證聯(lián)合用藥的效果。

材料與方法

一、材料

1.菌株來源：21株煙曲霉臨床株[AF5、AF7、AF8、AF9、AF10、AF13、AF18、AF19、AF20、AF21、AF23、AF24、AF26、AF27、AF30、AF31、AF38、AF46、0193、CBS542.75、CMCC(F)A.1a]，前 18 株由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗科王露霞副主任技師惠贈，后3株由中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所劉維達教授惠贈。質控菌株選用美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的近平滑念珠菌ATCC 22019株。

2.培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，pH 7.0)。

3.主要試劑：VRC(山東華禧藥業(yè)有限公司，批號20110510，純度 ＞98.5%)，TET(陜西慧科植物有限公司，批號20041226，純度98%)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)。

4.主要儀器：酶標儀(680型，美國Bio-Rad公司)，96孔板(美國Costar公司)。

二、方法

1.菌株的活化與菌懸液的配制：分別將受試菌株于PDA中在30℃下活化5～7 d，使用過濾器濾除菌絲后，稀釋于RPMI1640液體培養(yǎng)基中，經血細胞計數板計數孢子以調整菌液濃度，終濃度為(0.4～5.0)×104CFU/ml。

2.藥液配制：用DMSO將VRC溶解成5120 μg/ml的藥物儲備液；用滅菌雙蒸水將TET溶解成10 240 μg/ml的藥物儲備液，并用0.1 mol/L HCl將其調整成合適pH，使其充分溶解。各藥物儲備液分別過濾分裝后，在-20℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.測定TET及VRC單獨對煙曲霉的MIC：參照CLSI M38-A2方案[8]，將VRC、TET儲備液分別用RPMI1640稀釋為2倍工作濃度(VRC 0.007 5～8 μg/ml，TET 16 ～ 1 024 μg/ml)。 取其 100 μl經倍比稀釋后依次加入96孔板的第2～11列；除第12列外，其余各孔均加入 100 μl菌懸液，不足 200 μl液體的孔用RPMI1640補足。此時第1列為生長對照，第12列為空白對照。各孔中DMSO含量均不高于1%，對菌株生長無影響。將制備好的96孔板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以吸光度A值測定法判讀結果，確定MIC值。實驗重復3次，結果取中位數。

吸光度A值測定法：用酶標儀讀取各孔波長在405 nm處的A值。真菌生長百分數和真菌生長抑制百分數分別按以下公式計算：真菌生長百分率 =(各孔A值-空白對照孔A值)/(生長對照孔A值-空白對照孔A值)×100%；真菌生長抑制百分率=1-真菌生長百分率。

取真菌生長抑制率在90%以上的最低藥物濃度為MIC值[9]。

4.測定TET與VRC聯(lián)合抗煙曲霉的活性：參照CLSI M38-A2方案[8]，將VRC、TET儲備液分別用RPMI1640稀釋為4倍工作濃度(工作濃度范圍分別為：VRC 0.0075 ～ 8 μg/ml，TET 8 ～ 512 μg/ml)。按從低濃度到高濃度的順序，取50 μl倍比稀釋的VRC藥液，依次加入96孔板的第2～12列；按從高濃度到低濃度的順序，取50 μl倍比稀釋的TET藥液，依次加入96孔板的第A～G行。除A12孔，向其他孔各加入100 μl菌懸液，并用RPMI1640補足少于200 μl液體的孔。其中，H1孔為生長對照孔(不含藥液)，A12孔為空白對照孔(不含菌懸液)。將配制好的96孔板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以吸光度A值測定法判讀結果。實驗重復3次，結果取中位數。

5.藥物聯(lián)合作用效果的評價方法：結果評價采用CLSI建議的判定方法：FICI≤0.5為協(xié)同作用，且FICI越小，其協(xié)同作用越強；FICI＞4為拮抗作用；0.5＜FICI≤ 4為無關作用[10]。

等效線圖解法：通過棋盤法，以CMCC株為代表，將其MIC值按照等效線圖解法繪制，根據等效曲線的形狀可以判斷協(xié)同(凹形)、拮抗(凸形)、無關(直線)[11]。

結 果

1.質控標準：實驗中每次所測得的質控菌株ATCC 22019株對VRC的MIC值為0.06或0.125 μg/ml，均在CLSI M38-A2規(guī)定的參考范圍內，且生長對照孔生長良好，符合CLSI的要求。

2.TET與VRC單獨或聯(lián)合用藥的MIC：見表1，判斷煙曲霉對伏立康唑的敏感性是按照CLSI推薦的ECVs標準，以VRC的MIC≤1 μg/ml為敏感，2 μg/ml為劑量依賴性敏感， ＞ 2 μg/ml為耐藥[12]。 本實驗采用的21株煙曲霉臨床株中，除CMCC株為VRC劑量依賴性敏感株外，其余均為VRC敏感株。TET對上述煙曲霉臨床株的MIC值均為512 μg/ml，TET＜8 μg/ml時無抗菌作用，且無菌株差異性。

TET與 VRC聯(lián)合作用時，TET的 MIC值由512 μg/ml降至 8 ～ 256 μg/ml，VRC 的 MIC 值由0.125 ～ 2 μg/ml降至 0.03 ～ 0.5 μg/ml， 且終點清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失。說明TET可增強VRC抗煙曲霉的體外抗真菌活性。

表1 漢防己甲素與伏立康唑體外聯(lián)合作用于21株煙曲霉的最低抑菌濃度值及結果評價

圖1 漢防己甲素與伏立康唑聯(lián)合作用于CMCC株的真菌生長分數圖 灰色區(qū)域：生長分數超過10%的孔；黑色粗體部分：取分數抑菌濃度的位置；下劃線標注的黑色粗體：取分數抑菌濃度指數的位置

圖2 漢防己甲素與伏立康唑體外聯(lián)合作用于CMCC株的最低抑菌濃度值等效曲線

3.FICI法及其等效線圖解法對實驗結果的評價：見表1，TET與VRC聯(lián)合作用時，有76.2%的菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用，23.8%的菌株表現(xiàn)為無關作用，F(xiàn)ICI值為0.13～0.63，平均值為0.44＜0.5，說明TET與VRC聯(lián)合作用時主要表現(xiàn)為協(xié)同作用。

圖1反映了TET與VRC聯(lián)合作用于CMCC株時的真菌生長分數情況，通過計算黑色粗體部分的ΣFIC值，可知ΣFICmax為0.56＜4，即FICI值為ΣFICmin=0.16。圖2是其相應的等效曲線，凹形表明兩者具有協(xié)同作用。

討 論

VRC是氟康唑的衍生物，為第二代三唑類抗真菌藥物，抗菌譜廣，生物利用度高，是治療侵襲性曲霉病的一線藥物。然而，隨著VRC的廣泛應用，煙曲霉對其耐藥現(xiàn)象日益嚴重，給曲霉病的臨床治療帶來很大困難[1]。有研究表明，煙曲霉對VRC的耐藥機制可能與藥物外排過度有關[13]。

TET源于天然藥用植物防己，作用溫和、來源廣泛、價格低廉，已用于抗高血壓、抗心絞痛、抗腫瘤等治療領域。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，TET對氟康唑或酮康唑抗白念珠菌、聯(lián)苯芐唑或益康唑抗毛癬菌屬活性有增效作用，作用機制可能與抑制藥物外排 泵 基 因 MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表達有關[6]。鑒于此，我們參照CLSI推薦的M38-A2方案，采用棋盤法、FICI法及其等效線圖解法對本實驗進行抗真菌活性的測定和評價，以探討TET在體外對VRC抗煙曲霉是否有增效活性。

目前，本實驗采用的棋盤法、FICI法及其等效線圖解法已被廣泛應用于抗感染藥物體外聯(lián)合用藥的測評，具有操作簡便可行、重復性好等優(yōu)點。Loewe additivity(LA)理論是評價藥物聯(lián)合作用效果最為常用的數據處理方法，其核心思想是任何一種藥物本身無相互作用，即當觀察到的藥效比假設無相互作用的藥效高或低時，就分別稱為協(xié)同作用或拮抗作用。本實驗所采用的FICI法就是以LA理論為基礎發(fā)展出的非參數法模型。其公式為ΣFIC=FICA+FICB=CAcomb/MICAalone+CBcomb/MICBalone，式中的MICAalone和MICBalone分別為藥物A和B單用時的MIC，CAcomb和CBcomb為兩種藥物聯(lián)用時達到與單獨用藥相同藥效時各自的濃度。對于同一塊96孔板來說，計算數據獲得一系列ΣFIC值，當ΣFICmax(最大ΣFIC值)小于4時，F(xiàn)ICI定義為ΣFICmin(最小ΣFIC值)；否則FICI將定義為ΣFICmax。等效線圖解法是在FICI法基礎上用來驗證聯(lián)合作用效果的方法。若兩藥聯(lián)合后的MIC值降到單藥MIC的1/4即可認為兩藥有協(xié)同作用，這意味聯(lián)合用藥的ΣFIC≤0.5。對結果的判讀采用吸光度A值測定法，較肉眼觀察法具有客觀、定量、簡便等優(yōu)點。

按照CLSI推薦的ECV標準，本實驗選用的煙曲霉臨床株中有20株為VRC敏感株，1株為VRC劑量依賴性敏感株。在TET與VRC聯(lián)合用藥時，VRC的MIC較單獨應用時降低了1～4個梯度，且TET自身的MIC值也較單獨應用時降低了1～6個梯度。FICI(TET+VRC)平均值為0.44，＜0.5，表明TET對VRC抗煙曲霉有體外增效活性。我們還選用了劑量依賴性敏感株CMCC株繪制了相應的MIC值等效曲線，凹形也說明TET與VRC聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。

盡管絕大多數菌株為VRC敏感株，但因敏感性不同，其 FICI值也不同。 其中，F(xiàn)ICI(MIC≥1μg/ml)平均值為 0.36，F(xiàn)ICI(MIC＜1μg/ml)平均值為 0.49，即 TET 與 VRC聯(lián)合作用時對敏感性較低的菌株增效作用較強，而對敏感性較高的菌株增效作用較弱，說明TET在體外增強VRC抗煙曲霉的活性可能與逆轉其耐藥性有關。本實驗結果表明漢防己甲素對伏立康唑抗煙曲霉有體外增效活性，為臨床以漢防己甲素作為伏立康唑增效劑治療煙曲霉病提供了依據。

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2013-04-26)

(本文編輯：吳曉初)

In vitroevaluation of the activity of tetrandrine combined with voriconazole againstAspergillus fumigatusby a checkerboard method

Diao Wenqi*，Wu Rui，Song Yanjun，Li Shuixiu，Lyu Xialin，Wang Luxia，Liu Weida，Zhang Hong.*Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital；Institute of Mycology，Jinan University，Guangzhou 510632，China

Zhang Hong，Email:tzhangh@jnu.edu.cn

ObjectiveTo evaluate the synergistic effect of tetrandrine(TET)with voriconazole(VRC)againstAspergillus fumigatus.MethodsA checkerboard microdilution method was used to estimate the activity of TET combined with VRC against 21 clinical isolates ofAspergillus fumigatusaccording to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)M38-A2 document.The minimal inhibitory concentration(MIC)was determined using spectrophotometry.Fractional inhibitory concentration index(FICI)was calculated to evaluate the interaction between the two antifungal agents.The isobologram method was used to verify the test results with theAspergillus fumigatusstrain CMCC(F)A.1a as the representative strain.ResultsThe MICs of TET and VRC against these clinical isolates were 512 μg/ml and 0.125-2 μg/ml，respectively when used alone，8-128 μg/ml and 0.03-0.5 μg/ml respectively with clear end points accompanied by disappearance of the so-called"trailing"phenomenon when used in combination.The FICI of these agents ranged from 0.13 to 0.63.The interaction between TET and VRC was synergistic in 16 clinical isolates，but indifferent in the remaining strains.Moreover，the isobologram analysis revealed concaves with a shape characteristic of synergy.ConclusionTET exerts a synergistic effect with VRC againstAspergillus fumigatus.

Tetrandrine；Voriconazoles；Aspergillusfumigates；Synergisticeffect；Checkerboard microdilution method

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.007

國家自然科學基金(81171542)；廣東省科技計劃項目(2009B030801015)；廣州市科技支撐項目(2010J-E011)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(21611509)

510632廣州，暨南大學附屬第一醫(yī)院皮膚科、暨南大學真菌病研究所(刁文琦、吳銳、宋延君、李水秀、呂霞琳、張宏)；廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院(王露霞)；中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所(劉維達)

張宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn