周璐 胡彬 黃瑩雪 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

缺氧誘導(dǎo)因子1α在肢端惡性黑素瘤組織中的表達(dá)

周璐 胡彬 黃瑩雪 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

目的探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1α在肢端惡性黑素瘤(MM)中的表達(dá)及其與干細(xì)胞因子(SCF)/c-kit途徑的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)HIF-1α在93例MM、21例非肢端MM、39例肢端色素痣組織中的表達(dá)，并用15例肢端正常皮膚組織作對(duì)照。同時(shí)檢測(cè)c-kit在93例肢端MM組織中的表達(dá)情況，采用Spearman相關(guān)分析，分析其與HIF-1α的相關(guān)性。結(jié)果在93例肢端MM中，81例(87.10%)陽(yáng)性表達(dá)HIF-1α，在21例非肢端MM中19例(90.48%)陽(yáng)性，39例肢端色素痣中6例(15.38%)陽(yáng)性；15例肢端正常皮膚均為陰性。與肢端正常皮膚和肢端色素痣相比較，肢端MM中HIF-1α的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)；在肢端MM和非肢端MM組間，HIF-1α表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。HIF-1α表達(dá)水平與黑素瘤Clark分級(jí)、Breslow厚度分級(jí)均呈正相關(guān)(rs=0.442，P＜0.01；rs=0.368，P＜0.01)。在原位、侵襲性、轉(zhuǎn)移性肢端MM組織中，HIF-1α表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)(rs=0.420，P＜0.01)。在肢端MM中，HIF-1α表達(dá)與c-kit表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.307，P＜0.01)。結(jié)論HIF-1α蛋白在肢端MM中呈高表達(dá)，且與腫瘤的分期、進(jìn)展、侵襲性均呈正相關(guān)，與c-kit在肢端MM組織中的協(xié)同表達(dá)，提示可能共同參與肢端MM的發(fā)病機(jī)制。

黑色素瘤；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；原癌基因蛋白質(zhì)c-kit

皮膚惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤，致死率高，研究發(fā)現(xiàn)不同的人種中黑素瘤的發(fā)生率、臨床表現(xiàn)、組織學(xué)亞型和基因改變不盡相同，亞洲人種以肢端黑素瘤為主，而腫瘤位于肢端，提示其發(fā)生可能與肢端的缺氧微環(huán)境相關(guān)。眾所周知，組織缺氧是腫瘤微環(huán)境基本特征之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)1α是腫瘤缺氧反應(yīng)中關(guān)鍵性因子，既往文獻(xiàn)報(bào)道其在多種腫瘤中表達(dá)升高，與其中某些腫瘤的惡性程度及患者死亡率明顯相關(guān)[1-4]。在乳腺癌及胰腺癌中發(fā)現(xiàn)HIF-1α和干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)通過(guò)SCF/c-kit途徑誘導(dǎo)腫瘤血管生成及侵襲性增加[5-6]，而在黑素瘤中的相關(guān)研究報(bào)道較少[2，7]。我們推測(cè)在肢端黑素瘤中，可能存在低氧狀態(tài)誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)及SCF/c-kit途徑的異?；罨?，為進(jìn)一步探討HIF-1α在肢端黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及其與SCF/c-kit途徑的聯(lián)系，我們選擇肢端MM組織，觀察皮損中HIF-1α、c-kit的表達(dá)。

資料與方法

1.標(biāo)本:收集2010年1月至2013年6月期間在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院經(jīng)臨床及病理證實(shí)的肢端MM 93例，非肢端MM 21例，肢端色素痣39例，肢端正常皮膚組織15例。93例肢端MM患者中，女56例，男37例；發(fā)病年齡29～90歲，平均年齡59.94歲；原位腫瘤28例，侵襲性腫瘤58例，轉(zhuǎn)移性MM 7例；Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)38例，Ⅲ～Ⅴ級(jí)55例。21例非肢端MM患者中，女10例，男11例；發(fā)病年齡24～87歲，平均年齡62.99歲；原位腫瘤5例，侵襲性腫瘤16例；ClarkⅠ～Ⅱ級(jí)6例，Ⅲ～Ⅴ級(jí)15例。肢端色素痣39例，其中發(fā)育不良痣5例，普通良性痣34例。

2.標(biāo)本處理:所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋；4 μm厚度切片后常規(guī)HE染色或敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)先處理的載玻片上，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

3.試劑及儀器:鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(ab1)產(chǎn)自英國(guó)Abcam公司(工作濃度為1∶100)，即用型鼠抗人c-kit單克隆抗體、即用型羊抗鼠二抗、3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒均產(chǎn)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。顯微鏡工作臺(tái)及照相系統(tǒng)為日本Nikon公司產(chǎn)品。

4.免疫組化法:石蠟切片脫蠟脫水；Tris-EDTA緩沖液(0.01 mol/L，pH9.0)高溫高壓修復(fù) 3 min，室溫自然冷卻；后分別滴加抗HIF-1α抗體和抗c-kit抗體(其中抗c-kit抗體只在肢端MM組織切片中滴加)；濕盒中4℃過(guò)夜；再滴加二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用人卵巢鱗狀上皮細(xì)胞癌作HIF-1α染色陽(yáng)性對(duì)照，用肥大細(xì)胞瘤作c-kit陽(yáng)性對(duì)照。所有組織染色條件相同。

5.結(jié)果判定:判定標(biāo)準(zhǔn):腫瘤細(xì)胞核呈棕褐色顆粒著色為陽(yáng)性細(xì)胞。高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)全部有核細(xì)胞，分別計(jì)算切片中著色強(qiáng)度和著色陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。著色強(qiáng)度:強(qiáng)著色為3分，中等著色為2分，弱著色為1分，不著色或著色不清為0分；著色陽(yáng)性細(xì)胞的百分率＞50%為3分，10%～50%為2分，＜10%為1分，不著色為0分，最后將所計(jì)的分?jǐn)?shù)相乘得出最終的免疫組化積分。組化積分0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為(++)，＞6分為(+++)[8]。結(jié)果判定由2名皮膚病理醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；HIF-1α和腫瘤進(jìn)展、腫瘤分級(jí)及c-kit蛋白間相關(guān)性研究用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α均為0.05。

結(jié) 果

圖1 缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1α和c-kit在肢端侵襲性黑素瘤中的表達(dá)(DAB染色×200) 1a:HIF-1α染色；1b:c-kit染色 圖2 HIF-1α在良性色素痣中的陰性表達(dá)(DAB染色×100) 真皮淺層痣細(xì)胞成巢區(qū)域分布較多色素顆粒

1.HIF-1α蛋白的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示(圖1a)，在93例肢端MM中，陽(yáng)性表達(dá)81例(87.10%)。21例非肢端 MM中，19例陽(yáng)性(90.48%)；其中，5例原位腫瘤中3例陽(yáng)性；16例侵襲性腫瘤中7例陽(yáng)性(43.75%)。在39例色素痣(圖2)中6例陽(yáng)性(15.38%)；15例肢端正常皮膚均為陰性。與肢端正常皮膚組和肢端色素痣組比較，肢端MM組中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.258，62.889，均P＜ 0.01)；在侵襲性MM中，肢端組中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平顯著高于非肢端組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.081，P＜0.01)，在原位MM中，兩組的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.118，P＞0.05)。

2.HIF-1α蛋白表達(dá)與肢端MM患者臨床特征及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系(表1):93例肢端MM中，HIF-1α表達(dá)水平在Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)組與Ⅲ～Ⅴ級(jí)組間、有/無(wú)潰瘍組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，而在不同性別組間、Breslow厚度0～2 mm組與厚度＞2 mm組間、有/無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。在原發(fā)、侵襲性、轉(zhuǎn)移性肢端MM組織中，HIF-1α表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)(rs=0.420，P＜ 0.01)；HIF-1α 表達(dá)水平與腫瘤Clark分級(jí)、Breslow厚度分級(jí)均呈正相關(guān)(rs=0.442，P＜ 0.01；rs=0.368，P＜ 0.01)。

3.肢端MM中HIF-1α蛋白與c-kit表達(dá)的相關(guān)性(表2):93例肢端MM中，84例表達(dá)c-kit，其中 42例(圖 1b)(+++)，33例(++)，9例(+)，9例不表達(dá)；經(jīng)Spearman相關(guān)分析，HIF-1α與c-kit表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.307，P＜ 0.01)。

討 論

皮膚MM發(fā)生于人體的最外層組織，即距離中心循環(huán)系統(tǒng)最遠(yuǎn)、相對(duì)缺氧的皮膚組織內(nèi)[9]，而肢端皮膚缺氧程度較其他部位皮膚更甚，提示缺氧在肢端皮膚黑素瘤的發(fā)生中可能起到一定作用。

表1 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

亞洲人種以肢端MM為主，提示其發(fā)生可能與肢端的缺氧微環(huán)境相關(guān)。缺氧可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，且影響患者預(yù)后。腫瘤對(duì)缺氧的反應(yīng)主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)HIF-1α的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)[1]。HIF-1α調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)氧壓力的適應(yīng)性，影響腫瘤細(xì)胞的重塑、代謝、增殖、存活、侵襲、凋亡及血管形成中等相關(guān)基因的表達(dá)[1-2，10]。HIF-1α在乳腺癌、腸癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤均有高表達(dá)，且與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)[2-3，11]。此外，研究亦發(fā)現(xiàn)HIF-1α還可誘導(dǎo)腫瘤對(duì)治療的抵抗，減弱機(jī)體抗腫瘤的適應(yīng)性免疫，而HIF-1α表達(dá)越高，患者預(yù)后及對(duì)治療的反應(yīng)越差[12-13]。以上研究均提示HIF-1α在腫瘤形成和進(jìn)展中有重要的作用，為腫瘤的治療同樣提供了新的靶點(diǎn)。

表2 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中HIF-1α表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、分期及c-kit表達(dá)間的相關(guān)分析

缺氧條件下，腫瘤內(nèi)HIF-1α蛋白水平升高，一方面，其可與SCF啟動(dòng)子中功能性缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-response element，HRE)區(qū)域相結(jié)合，從而活化SCF及其受體c-kit，激活下游PI3K/Akt通路，引起腫瘤細(xì)胞的增殖、血管形成，并增加侵襲相關(guān)基因的表達(dá)[6，14]。 另一方面，Monsel等[7]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α還可使含有突變型c-Kit基因的黑素瘤細(xì)胞增殖活化，亦能激活下游PI3K/Akt通路，激活腫瘤的一系列生物學(xué)行為。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在肢端MM中，HIF-1α蛋白的表達(dá)水平明顯高于肢端良性色素痣，且與腫瘤的分期、進(jìn)展、侵襲性均呈正相關(guān)，提示HIF-1α在肢端MM組織中高表達(dá)，可能參與肢端MM的發(fā)病機(jī)制；在侵襲性腫瘤中，肢端MM中HIF-1α蛋白的表達(dá)高于非肢端MM，提示肢端部位腫瘤進(jìn)展和缺氧微環(huán)境的關(guān)系較非肢端部位的腫瘤更密切。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在肢端MM中，HIF-1α與c-kit蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步佐證了HIF-1α與c-kit基因的表達(dá)在誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞活化、增殖等方面具有協(xié)同作用。目前，關(guān)于HIF-1α在腫瘤，特別是肢端MM發(fā)病機(jī)制方面的研究仍較廣泛，具體機(jī)制尚不明確，提示可能通過(guò)多條途徑影響腫瘤的發(fā)病過(guò)程。而HIF-1α與c-kit在肢端MM組織中的協(xié)同表達(dá)，提示在抗腫瘤治療中，也許可以聯(lián)合應(yīng)用HIF-1α與c-kit的拮抗劑，從而為黑素瘤的治療提供新的治療策略。

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2014-01-17)

(本文編輯:尚淑賢)

Expression of hypoxia-inducible factor-1α in acral malignant melanoma tissue

Zhou Lu，Hu Bin，Huang Yingxue，Shao Xuebao，Li Amei，Chen Hao，Sun Jianfang*.*Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s：Chen Hao，Email：ch76ch@163.com；Sun Jianfang，Email：sunjf57@163.com

ObjectiveTo measure the expression of hypoxia-inducible factor(HIF)-1α in acral malignant melanoma(MM)tissue and to investigate its relationship with the stem cell factor(SCF)/c-kit pathway.MethodsImmunohistochemical staining was performed to measure the expression of HIF-1α in tissue specimens from lesions of 93 patients with acral MM，21 with non-acral MM，39 with acral melanocytic nevi，and from the normal acral skin of 15 healthy human controls.Meanwhile，the expression of c-kit was detected by immunohistochemical staining in the 93 acral MM tissue specimens.Statistical comparisons were carried out by chi-square test and Mann-WhitneyUtest.The relationship of HIF-1α expression with c-kit expression as well as tumor progression and staging was assessed by Spearman correlation analysis.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression rate of HIF-1α was 87.10%(81/93)in acral MM specimens，90.48%(19/21)in non-acral MM specimens，15.38%(6/39)in acral melanocytic nevus specimens，but 0(0/15)in the normal acral skin specimens.The expression of HIF-1α was significantly higher in acral MM lesions than in normal acral skin and acral melanocytic nevus lesions(bothP＜0.01)，and significantly different between acral MM and non-acral MM lesions(P＜ 0.01).Moreover，HIF-1α expression was positively correlated with Clark level and Breslow depth of melanoma(rs=0.442，0.368，respectively，bothP＜ 0.01)，with the progression of acral MM(fromin situto aggressive and metastatic MM)(rs=0.420，P＜ 0.01)，and with the expression of c-kit(rs=0.307，P＜ 0.01).Conclusions HIF-1α is highly expressed in acral MM，positively correlated with the staging，progression and aggression of MM，and co-expressed with c-kit in acral MM tissue，suggesting that both HIF-1α and c-kit take part in the pathogenesis of acral MM.

Melanoma；Hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；Proto-oncogene proteins c-kit

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102067)

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所[周璐(現(xiàn)在青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，266000)、胡彬、黃瑩雪、邵雪寶、李阿梅、陳浩、孫建方]

陳浩，Email:ch76ch@163.com；孫建方，Email:sunjf57@163.com