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        三種黃芩提取物誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞凋亡的研究

        2014-12-09 05:12:23劉梅周春林朱紅金光玉陳洪鐸何春滌
        中華皮膚科雜志 2014年9期
        關(guān)鍵詞:鱗狀鱗癌黃芩

        劉梅 周春林 朱紅 金光玉 陳洪鐸 何春滌

        三種黃芩提取物誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞凋亡的研究

        劉梅 周春林 朱紅 金光玉 陳洪鐸 何春滌

        目的探討黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素3種黃芩提取物對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株SCL-1細(xì)胞凋亡的影響。方法將培養(yǎng)的SCL-1細(xì)胞分別用濃度為12.5、25、50、75、100 μmol/L的3種黃芩提取物作用12、24、48 h后,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測上述藥物對SCL-1細(xì)胞的生長抑制作用。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠雙染法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測SCL-1細(xì)胞凋亡率。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。應(yīng)用線性內(nèi)差法,測定半數(shù)抑制濃度(IC50);兩樣本均數(shù)比較用Studentt檢驗(yàn);多樣本均數(shù)比較采用方差分析,各樣本之間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果3種黃芩提取物均可抑制SCL-1細(xì)胞的生長,并具有濃度及時間依賴性(均P<0.01);在相同的藥物濃度及作用時間下,黃芩素對SCL-1細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng),黃芩苷抑制作用最弱,漢黃芩素抑制作用介于二者之間,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別作用SCL-1細(xì)胞48 h均可誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程,其中G1期細(xì)胞比例分別為56.37% ±2.41%、74.23% ±2.02%、64.15% ±1.87%, 早期凋亡率分別為8.09% ±1.02%、24.13% ±0.76%、14.45% ±1.57%,與對照組(45.04% ±1.93%,4.12% ±0.29%)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.29,186.37,均P<0.01);其中黃芩素作用最強(qiáng),其次為漢黃芩素,黃芩苷作用最弱。結(jié)論黃芩能抑制SCL-1細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡,為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的中藥治療開拓新的思路。

        黃芩;黃芩苷;黃芩素;漢黃芩素;癌,鱗狀細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

        皮膚鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)是最常見的皮膚惡性腫瘤之一,其發(fā)病率約占全部非黑素性皮膚惡性腫瘤的20%[1],嚴(yán)重影響人類健康[2]。黃芩是應(yīng)用較廣的一種中草藥,具有廣泛的生物學(xué)活性。目前國內(nèi)外研究表明,黃芩具有抗腫瘤作用,可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[3-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素3種黃芩提取物在體外誘導(dǎo)人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞凋亡的作用并探討其機(jī)制。

        材料與方法

        一、主要材料和試劑

        1.細(xì)胞:人皮膚鱗癌細(xì)胞株SCL-1由德國柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈。

        2.主要試劑:3種黃芩提取物(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素)產(chǎn)自日本W(wǎng)ako公司;細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清產(chǎn)自美國Hyclone公司;噻唑藍(lán)(MTT)、碘化丙錠(PI)、二甲基亞砜(DMSO)、丫啶橙均為美國Sigma公司產(chǎn)品;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染檢測試劑盒產(chǎn)自美國BD公司;細(xì)胞死亡檢測酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Cell Death Detection ELISA)試劑盒產(chǎn)自德國Roche公司。

        二、方法

        1.細(xì)胞培養(yǎng):將SCL-1細(xì)胞接種于含有10%胎牛 血 清 、100 U/ml 青 霉 素 、100 μg/ml 鏈 霉 素 的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

        2.噻唑藍(lán)(MTT)檢測黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞的增殖抑制作用:將SCL-1細(xì)胞接種在96孔板上(每孔接種103個細(xì)胞),于對數(shù)生長期向細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度為 12.5、25、50、75、100 μmol/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素(均用終濃度為0.1%的DMSO配制),體積為180 μl/孔,每個濃度設(shè)6個復(fù)孔,各設(shè)6個對照復(fù)孔,對照組加終濃度為0.1%的DMSO。每隔24小時更換含同樣藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)12、24、48 h后,每孔加入 MTT 20 μl,37 ℃孵育 4 h, 棄上清液,每孔加入150 μl DMSO,振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光度A值,同時計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(加藥組A值/對照組A值)×100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

        3.Annexin-V/PI雙染檢測早期凋亡:用12.5μmol/L黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別作用于SCL-1細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞,Annexin-V和PI染色,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

        4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞凋亡:將SCL-1細(xì)胞接種于96孔板,于對數(shù)生長期向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為12.5 μmol/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素,體積為180 μl/孔,各設(shè)3個復(fù)孔,對照組加終濃度為0.1%的DMSO,間隔24 h更換含同樣藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后按試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡。

        5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:用12.5 μmol/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素分別作用于SCL-1細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞,冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,用75%冰乙醇固定過夜,加入含核糖核酸酶的碘化丙錠,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        一、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞增殖抑制作用的比較

        MTT結(jié)果顯示,3種黃芩提取物均可以抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞株SCL-1細(xì)胞增殖,隨著作用時間的延長及藥物濃度的增加,細(xì)胞存活率顯著下降,呈明顯的濃度與時間依賴性(r值分別為-0.67,-0.42,均P<0.01)。在相同的藥物濃度及作用時間下,黃芩素對SCL-1細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng),黃芩苷抑制作用最弱,漢黃芩素抑制作用介于二者之間;差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素在48 h對SCL-1細(xì)胞的IC50分別為88.23、18.78、48.37 μmol/L。 見圖 1。

        二、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞早期凋亡的影響

        12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素分別作用于SCL-1細(xì)胞48 h后,均能誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞早期凋亡,早期凋亡率分別為8.09%±1.02%、24.13%±0.76%、14.45%±1.57%,而對照組早期凋亡率為4.12%±0.29%,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=186.37,P<0.01);其中黃芩素凋亡誘導(dǎo)作用最強(qiáng),黃芩苷最弱,漢黃芩素介于二者之間,見圖2。

        三、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

        12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素均能誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞凋亡,A值分別為0.415±0.047,0.705±0.078,0.574±0.064,與對照組(0.239± 0.048)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),黃芩素對SCL-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于漢黃芩素及黃芩苷,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

        圖1 3種黃芩提取物對SCL-1細(xì)胞的增殖抑制作用

        圖2 3種黃芩提取物對SCL-1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 2a:溶媒對照;2b:黃芩苷;2c:漢黃芩素;2d:黃芩素

        圖3 3種黃芩提取物對SCL-1細(xì)胞周期的阻滯 3a:對照;3b:黃芩苷;3c:漢黃芩素;3d:黃芩素

        四、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

        12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素作用SCL-1細(xì)胞48 h后,與對照組比較,均能夠阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程,將細(xì)胞阻滯于G1期(圖3)。其中黃芩素作用最強(qiáng),G1期細(xì)胞比例為74.23%±2.02%,其次為漢黃芩素(64.15%±1.87%),黃芩苷作用最弱(56.37%±2.41%),各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.29,P< 0.01)。

        討 論

        黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根,性寒、味苦,具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效,在臨床中屬于常用中藥。黃芩中生物活性成分是黃酮類化合物,主要有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。黃芩在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的研究是近幾年來國內(nèi)外醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一。最為重要的是,黃芩對正常上皮細(xì)胞、正常外周血細(xì)胞及骨髓細(xì)胞沒有或僅有輕微的毒性作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn),黃芩可能是通過以下幾種機(jī)制來抑制腫瘤細(xì)胞增殖的:①抑制花生四烯酸代謝的脂氧合酶(LOX)途徑:12-LOX可將花生四烯酸代謝為12-羥基廿碳四烯酸(12-HETE),后者對惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng);黃芩素作為12-LOX的選擇性抑制劑,可以誘導(dǎo)和加速前列腺癌細(xì)胞凋亡[5];②降低與細(xì)胞周期相關(guān)的酶及蛋白的表達(dá),影響細(xì)胞周期分布:黃芩素可使人骨肉瘤細(xì)胞阻滯于G1期[6];③誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑:如黃芩苷誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡是通過線粒體凋亡途徑[7];④下調(diào)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性:如漢黃芩素通過抑制端粒酶活性而誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡[8];⑤作用于與凋亡相關(guān)的基因與蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡:如黃芩誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡,上調(diào)p53和bax的表達(dá)[9];⑥通過抑制環(huán)氧化酶(COX)-2進(jìn)而抑制前列腺素E2(PGE2)的合成并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡:如黃芩誘導(dǎo)人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[10]。

        本研究以培養(yǎng)的人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞株為研究對象,比較3種黃芩提取物(黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素)對其生長的影響。研究結(jié)果顯示,黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素均能不同程度地抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞增殖,呈明顯的濃度與時間依賴性;其中黃芩素對人皮膚鱗癌細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng),黃芩苷作用最弱,漢黃芩素介于二者之間。Annxin V/PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)和ELISA結(jié)果顯示,3種黃芩提取物均能誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞凋亡,其中黃芩素凋亡誘導(dǎo)作用最為顯著,黃芩苷最弱,漢黃芩素介于二者之間;提示中藥黃芩對人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞的增殖抑制可能與凋亡的誘導(dǎo)作用有關(guān)。

        腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的復(fù)雜過程,由細(xì)胞周期調(diào)控紊亂所致的細(xì)胞無限增殖,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[11]。我們的研究結(jié)果顯示,3種黃芩提取物均能阻滯人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞周期進(jìn)程,將細(xì)胞阻滯于G1期,其中黃芩素的作用最為顯著,提示中藥黃芩可以通過阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程而抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡。

        隨著皮膚鱗癌發(fā)病率的持續(xù)上升,早期干預(yù)及防治已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的一個問題。我們在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)[12],3種維A酸(全反式維A酸、阿維A及他扎羅汀)均能抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞生長及誘導(dǎo)其凋亡。然而,由于維A酸類藥物具有較強(qiáng)的致畸性,常會引起患者血脂升高及肝功能損害,使其臨床應(yīng)用受到一定限制。本研究從體外證實(shí)中藥黃芩具有抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡作用,從而為皮膚鱗癌的中藥治療開拓新的思路。

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        [4]劉梅,王珍,肖汀,等.黃芩素、阿維A誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-12細(xì)胞凋亡的研究[J].中華皮膚科雜志,2010,43(11):753-757.

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        2013-09-12)

        (本文編輯:尚淑賢)

        Three Scutellaria baicalensisextracts induce the apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line SCL-1:an experimental study

        Liu Mei,Zhou Chunlin,Zhu Hong,Jin Guangyu,Chen Hongduo,He Chundi.Key Laboratory of Immunodermatology of Ministry of Health;Department of Dermatology,F(xiàn)irst Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

        He Chundi,Email:chundihe@hotmail.com

        ObjectiveTo investigate the effect of threeScutellaria baicalensisextracts(baicalin,baicalein and wogonin)on the apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line,SCL-1.MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to detect the proliferation of cultured SCL-1 cells treated with different concentrations(12.5,25,50,75 and 100 μmol/L)of baicalin,baicalein and wogonin for various durations(12,24 and 48 hours).Some SCL-1 cells were treated with baicalin,baicalein and wogonin of 12.5 μmol/L respectively for 48 hours followed by the detection of cell apoptosis by double staining with annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide in combination with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),as well as estimation of cell cycle by flow cytometry.The 50%inhibitory concentration was determined by line regression model and inner insert method,and statistical analysis was carried out by Student'sttest,one-way analysis of variance(ANOVA),and Student-Newman-Keuls-q test.ResultsBaicalin,baicalein and wogonin all inhibited the proliferation of SCL-1 cells in a dose-and time-dependent manner(allP<0.01).Under the same conditions(treatment concentration and duration),baicalein showed the strongest inhibitory effect on the proliferation of SCL-1 cells,followed by wogonin and baicalin(allP< 0.01).All theScutellaria baicalensisextracts induced the apoptosis of SCL-1 cells and arrested them in G1-phase.The percentage of cells in G1 phase was 56.37% ±2.41%,74.23% ±2.02%and 64.15%±1.87%,and early apoptosis rate was 8.09%±1.02%,24.13% ±0.76%and 14.45% ±1.57%,in SCL-1 cells treated with baicalin,baicalein and wogonin of 12.5 μmol/L for 48 hours,respectively,compared to 45.04% ± 1.93%and 4.12% ± 0.29%in the untreated control cells respectively(F=83.29,186.37,respectively,bothP< 0.01).Similarly,there was a downward trend from baicalein to wogonin and baicalin in the effect on cell apoptosis and cell cycle arrest of SCL-1 cells.ConclusionsScutellaria baicalensiscan inhibit the growth and induce the apoptosis of SCL-1 cells,which may provide new ideas for the treatment of cutaneous squamous cell carcinoma with traditional Chinese drugs.

        Scutellaria baicalensis;Baicalin;Baicalein;Wogonin;Carcinoma,squamous cell;Apoptosis

        10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.011

        遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2012225016);遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目計(jì)劃(2008T193);遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LR201040);遼寧特聘教授資助課題(遼教發(fā)[2012]145)

        110001沈陽,中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科,衛(wèi)生部免疫皮膚病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

        何春滌,Email:chundihe@hotmail.com

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