劉梅 周春林 朱紅 金光玉 陳洪鐸 何春滌

三種黃芩提取物誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞凋亡的研究

劉梅 周春林 朱紅 金光玉 陳洪鐸 何春滌

目的探討黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素3種黃芩提取物對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株SCL-1細(xì)胞凋亡的影響。方法將培養(yǎng)的SCL-1細(xì)胞分別用濃度為12.5、25、50、75、100 μmol/L的3種黃芩提取物作用12、24、48 h后，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測上述藥物對SCL-1細(xì)胞的生長抑制作用。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠雙染法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測SCL-1細(xì)胞凋亡率。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。應(yīng)用線性內(nèi)差法，測定半數(shù)抑制濃度(IC50)；兩樣本均數(shù)比較用Studentt檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較采用方差分析，各樣本之間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果3種黃芩提取物均可抑制SCL-1細(xì)胞的生長，并具有濃度及時間依賴性(均P＜0.01)；在相同的藥物濃度及作用時間下，黃芩素對SCL-1細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng)，黃芩苷抑制作用最弱，漢黃芩素抑制作用介于二者之間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別作用SCL-1細(xì)胞48 h均可誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，其中G1期細(xì)胞比例分別為56.37% ±2.41%、74.23% ±2.02%、64.15% ±1.87%， 早期凋亡率分別為8.09% ±1.02%、24.13% ±0.76%、14.45% ±1.57%，與對照組(45.04% ±1.93%，4.12% ±0.29%)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.29，186.37，均P＜0.01)；其中黃芩素作用最強(qiáng)，其次為漢黃芩素，黃芩苷作用最弱。結(jié)論黃芩能抑制SCL-1細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的中藥治療開拓新的思路。

黃芩；黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素；癌，鱗狀細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占全部非黑素性皮膚惡性腫瘤的20%[1]，嚴(yán)重影響人類健康[2]。黃芩是應(yīng)用較廣的一種中草藥，具有廣泛的生物學(xué)活性。目前國內(nèi)外研究表明，黃芩具有抗腫瘤作用，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[3-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素3種黃芩提取物在體外誘導(dǎo)人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞凋亡的作用并探討其機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料和試劑

1.細(xì)胞:人皮膚鱗癌細(xì)胞株SCL-1由德國柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈。

2.主要試劑:3種黃芩提取物(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素)產(chǎn)自日本W(wǎng)ako公司；細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清產(chǎn)自美國Hyclone公司；噻唑藍(lán)(MTT)、碘化丙錠(PI)、二甲基亞砜(DMSO)、丫啶橙均為美國Sigma公司產(chǎn)品；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染檢測試劑盒產(chǎn)自美國BD公司；細(xì)胞死亡檢測酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Cell Death Detection ELISA)試劑盒產(chǎn)自德國Roche公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):將SCL-1細(xì)胞接種于含有10%胎牛 血 清 、100 U/ml 青 霉 素 、100 μg/ml 鏈 霉 素 的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

2.噻唑藍(lán)(MTT)檢測黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞的增殖抑制作用:將SCL-1細(xì)胞接種在96孔板上(每孔接種103個細(xì)胞)，于對數(shù)生長期向細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度為 12.5、25、50、75、100 μmol/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素(均用終濃度為0.1%的DMSO配制)，體積為180 μl/孔，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，各設(shè)6個對照復(fù)孔，對照組加終濃度為0.1%的DMSO。每隔24小時更換含同樣藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入 MTT 20 μl，37 ℃孵育 4 h， 棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光度A值，同時計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(加藥組A值/對照組A值)×100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

3.Annexin-V/PI雙染檢測早期凋亡:用12.5μmol/L黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別作用于SCL-1細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，Annexin-V和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞凋亡:將SCL-1細(xì)胞接種于96孔板，于對數(shù)生長期向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為12.5 μmol/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素，體積為180 μl/孔，各設(shè)3個復(fù)孔，對照組加終濃度為0.1%的DMSO，間隔24 h更換含同樣藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后按試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡。

5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:用12.5 μmol/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素分別作用于SCL-1細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用75%冰乙醇固定過夜，加入含核糖核酸酶的碘化丙錠，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞增殖抑制作用的比較

MTT結(jié)果顯示，3種黃芩提取物均可以抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞株SCL-1細(xì)胞增殖，隨著作用時間的延長及藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著下降，呈明顯的濃度與時間依賴性(r值分別為-0.67，-0.42，均P＜0.01)。在相同的藥物濃度及作用時間下，黃芩素對SCL-1細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng)，黃芩苷抑制作用最弱，漢黃芩素抑制作用介于二者之間；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素在48 h對SCL-1細(xì)胞的IC50分別為88.23、18.78、48.37 μmol/L。 見圖 1。

二、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞早期凋亡的影響

12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素分別作用于SCL-1細(xì)胞48 h后，均能誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞早期凋亡，早期凋亡率分別為8.09%±1.02%、24.13%±0.76%、14.45%±1.57%，而對照組早期凋亡率為4.12%±0.29%，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=186.37，P＜0.01)；其中黃芩素凋亡誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，黃芩苷最弱，漢黃芩素介于二者之間，見圖2。

三、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素均能誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞凋亡，A值分別為0.415±0.047，0.705±0.078，0.574±0.064，與對照組(0.239± 0.048)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，黃芩素對SCL-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于漢黃芩素及黃芩苷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

圖1 3種黃芩提取物對SCL-1細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2 3種黃芩提取物對SCL-1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 2a:溶媒對照；2b:黃芩苷；2c:漢黃芩素；2d:黃芩素

圖3 3種黃芩提取物對SCL-1細(xì)胞周期的阻滯 3a:對照；3b:黃芩苷；3c:漢黃芩素；3d:黃芩素

四、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對SCL-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

12.5 μmol/L黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素作用SCL-1細(xì)胞48 h后，與對照組比較，均能夠阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，將細(xì)胞阻滯于G1期(圖3)。其中黃芩素作用最強(qiáng)，G1期細(xì)胞比例為74.23%±2.02%，其次為漢黃芩素(64.15%±1.87%)，黃芩苷作用最弱(56.37%±2.41%)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.29，P＜ 0.01)。

討 論

黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，性寒、味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，在臨床中屬于常用中藥。黃芩中生物活性成分是黃酮類化合物，主要有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。黃芩在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的研究是近幾年來國內(nèi)外醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一。最為重要的是，黃芩對正常上皮細(xì)胞、正常外周血細(xì)胞及骨髓細(xì)胞沒有或僅有輕微的毒性作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，黃芩可能是通過以下幾種機(jī)制來抑制腫瘤細(xì)胞增殖的:①抑制花生四烯酸代謝的脂氧合酶(LOX)途徑:12-LOX可將花生四烯酸代謝為12-羥基廿碳四烯酸(12-HETE)，后者對惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)；黃芩素作為12-LOX的選擇性抑制劑，可以誘導(dǎo)和加速前列腺癌細(xì)胞凋亡[5]；②降低與細(xì)胞周期相關(guān)的酶及蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期分布:黃芩素可使人骨肉瘤細(xì)胞阻滯于G1期[6]；③誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑:如黃芩苷誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡是通過線粒體凋亡途徑[7]；④下調(diào)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性:如漢黃芩素通過抑制端粒酶活性而誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡[8]；⑤作用于與凋亡相關(guān)的基因與蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡:如黃芩誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡，上調(diào)p53和bax的表達(dá)[9]；⑥通過抑制環(huán)氧化酶(COX)-2進(jìn)而抑制前列腺素E2(PGE2)的合成并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡:如黃芩誘導(dǎo)人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[10]。

本研究以培養(yǎng)的人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞株為研究對象，比較3種黃芩提取物(黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素)對其生長的影響。研究結(jié)果顯示，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素均能不同程度地抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞增殖，呈明顯的濃度與時間依賴性；其中黃芩素對人皮膚鱗癌細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng)，黃芩苷作用最弱，漢黃芩素介于二者之間。Annxin V/PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)和ELISA結(jié)果顯示，3種黃芩提取物均能誘導(dǎo)SCL-1細(xì)胞凋亡，其中黃芩素凋亡誘導(dǎo)作用最為顯著，黃芩苷最弱，漢黃芩素介于二者之間；提示中藥黃芩對人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞的增殖抑制可能與凋亡的誘導(dǎo)作用有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的復(fù)雜過程，由細(xì)胞周期調(diào)控紊亂所致的細(xì)胞無限增殖，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[11]。我們的研究結(jié)果顯示，3種黃芩提取物均能阻滯人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞周期進(jìn)程，將細(xì)胞阻滯于G1期，其中黃芩素的作用最為顯著，提示中藥黃芩可以通過阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程而抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡。

隨著皮膚鱗癌發(fā)病率的持續(xù)上升，早期干預(yù)及防治已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的一個問題。我們在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)[12]，3種維A酸(全反式維A酸、阿維A及他扎羅汀)均能抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞生長及誘導(dǎo)其凋亡。然而，由于維A酸類藥物具有較強(qiáng)的致畸性，常會引起患者血脂升高及肝功能損害，使其臨床應(yīng)用受到一定限制。本研究從體外證實(shí)中藥黃芩具有抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡作用，從而為皮膚鱗癌的中藥治療開拓新的思路。

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2013-09-12)

(本文編輯:尚淑賢)

Three Scutellaria baicalensisextracts induce the apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line SCL-1：an experimental study

Liu Mei，Zhou Chunlin，Zhu Hong，Jin Guangyu，Chen Hongduo，He Chundi.Key Laboratory of Immunodermatology of Ministry of Health；Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China

He Chundi，Email：chundihe@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of threeScutellaria baicalensisextracts(baicalin，baicalein and wogonin)on the apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line，SCL-1.MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to detect the proliferation of cultured SCL-1 cells treated with different concentrations(12.5，25，50，75 and 100 μmol/L)of baicalin，baicalein and wogonin for various durations(12，24 and 48 hours).Some SCL-1 cells were treated with baicalin，baicalein and wogonin of 12.5 μmol/L respectively for 48 hours followed by the detection of cell apoptosis by double staining with annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide in combination with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，as well as estimation of cell cycle by flow cytometry.The 50%inhibitory concentration was determined by line regression model and inner insert method，and statistical analysis was carried out by Student'sttest，one-way analysis of variance(ANOVA)，and Student-Newman-Keuls-q test.ResultsBaicalin，baicalein and wogonin all inhibited the proliferation of SCL-1 cells in a dose-and time-dependent manner(allP＜0.01).Under the same conditions(treatment concentration and duration)，baicalein showed the strongest inhibitory effect on the proliferation of SCL-1 cells，followed by wogonin and baicalin(allP＜ 0.01).All theScutellaria baicalensisextracts induced the apoptosis of SCL-1 cells and arrested them in G1-phase.The percentage of cells in G1 phase was 56.37% ±2.41%，74.23% ±2.02%and 64.15%±1.87%，and early apoptosis rate was 8.09%±1.02%，24.13% ±0.76%and 14.45% ±1.57%，in SCL-1 cells treated with baicalin，baicalein and wogonin of 12.5 μmol/L for 48 hours，respectively，compared to 45.04% ± 1.93%and 4.12% ± 0.29%in the untreated control cells respectively(F=83.29，186.37，respectively，bothP＜ 0.01).Similarly，there was a downward trend from baicalein to wogonin and baicalin in the effect on cell apoptosis and cell cycle arrest of SCL-1 cells.ConclusionsScutellaria baicalensiscan inhibit the growth and induce the apoptosis of SCL-1 cells，which may provide new ideas for the treatment of cutaneous squamous cell carcinoma with traditional Chinese drugs.

Scutellaria baicalensis；Baicalin；Baicalein；Wogonin；Carcinoma，squamous cell；Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.011

遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2012225016)；遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目計(jì)劃(2008T193)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LR201040)；遼寧特聘教授資助課題(遼教發(fā)[2012]145)

110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，衛(wèi)生部免疫皮膚病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

何春滌，Email:chundihe@hotmail.com