■叢立新 張國(guó)良 李 鵬 張連江 張 輝

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林省吉林市 132101；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林省吉林市 132101)

肌內(nèi)脂肪含量與肉質(zhì)密切相關(guān)，優(yōu)質(zhì)牛肉肌內(nèi)脂肪含量高，具有明顯的大理石紋。肌內(nèi)脂肪影響肉的嫩度、風(fēng)味、肉色、系水力[1]。脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）是脂肪細(xì)胞表達(dá)最豐富的細(xì)胞因子，大量存在于血液循環(huán)中。相關(guān)文獻(xiàn)表明，ADPN是脂肪代謝的重要調(diào)控因子[2]。本課題組成員研究結(jié)果，ADPN水平和奶牛圍產(chǎn)期的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，脂聯(lián)素有望成為調(diào)節(jié)肉牛肌內(nèi)脂肪最有前途的候選基因。

通過(guò)觀測(cè)延邊黃年、草原紅牛育肥的不同階段主要肌肉塊中肌內(nèi)脂肪的含量、ADPN mRNA水平及其與肉牛肌肉大理石紋等級(jí)的關(guān)系，為探尋肉牛與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的基因提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

各選擇30頭健康、體況相同、體重接近、18月齡左右的延邊黃牛和草原紅牛，分別隨機(jī)分成3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)小組均10頭牛，供試肉牛單圈單槽飼喂。預(yù)試期10 d，精飼料日喂量逐漸增加到設(shè)定的營(yíng)養(yǎng)水平后，進(jìn)入正式肥育試驗(yàn)期，肥育時(shí)間6個(gè)月（前期4個(gè)月，后期2個(gè)月）。試驗(yàn)期間，分別于育肥的每月齡末采集脂肪樣品（尾部），熒光定量RT-PCR法檢測(cè)ADPN基因表達(dá)量（mRNA水平）。肥育期結(jié)束時(shí)從每個(gè)重復(fù)組中隨機(jī)抽測(cè)3頭肉牛屠宰。屠宰后采集眼肉等主要的肌肉樣品，檢測(cè)其脂肪的含量，評(píng)定大理石紋等級(jí)。

1.2 試驗(yàn)試劑

1.2.1 主要試劑與工具酶

Trizol試劑購(gòu)自Gibco公司；瓊脂糖（Promega）、酵母浸提物、Tris購(gòu)自TaKaRa公司；焦磷酸二乙酯（DEPC）購(gòu)自Sigm；乙醇、異丙醇、氯仿均為分析純國(guó)產(chǎn)試劑；乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、十二基烷硫酸鈉（SDS）、飽和酚等為長(zhǎng)春Biotech公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)分子量DL-2000 Marker購(gòu)自TaKaRa公司。反轉(zhuǎn)錄酶AMV Reverse Transcriptase為NEB公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、RNasin為Promage公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶為TaKaRa公司生立，DH5α宿主菌為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

恒溫空氣浴振蕩器（上海智城ZHWY-103D）；GeneQuant核酸濃度測(cè)定儀（英國(guó)pharmacia Biotech，Ltd公司）；不銹鋼數(shù)顯式鼓風(fēng)干燥箱；紫外線透射反射儀WP型（永嘉上塘儀器廠）；脂肪測(cè)定儀（SZF-06A上海新嘉電子有限公司）；7930型高速冷凍立式離心機(jī)（日本KUBOTA公司）；PCR儀Tpersonal2000型(德國(guó)Biometra公司)、DY-Ⅲ型電泳儀（北京六一儀器廠）；恒溫水浴箱（丹東市醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）；ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）。

1.3 日糧營(yíng)養(yǎng)水平與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間，同一肉牛品種同一育肥階段喂飼相同的日糧，不同育肥階段飼喂不同的日糧。粗飼料自由采食，以玉米秸桿為主。試驗(yàn)期間肉牛日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.4 采集肉樣

分別于育肥的每月齡末，采集尾部脂肪樣品300 mg，存于液氮中備用。于育肥的22月齡末、24月齡末肉牛屠宰時(shí)，以眼肉評(píng)定大理石紋等級(jí)，并采集胴體中主要肌肉塊樣品：眼肉、胸肉、上腦、腱子肉、腰肉各100 mg于-20℃保存，待測(cè)肌內(nèi)脂肪含量。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

主要肌肉樣脂肪含量，為肌肉干物質(zhì)中脂肪所占百分比IMF(mg/g)，（索氏浸提法）。

脂肪樣品中ADPN mRNA水平（熒光定量RTPCR法）。

肌肉大理石紋等級(jí)（中國(guó)優(yōu)質(zhì)牛肉等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）。

1.6 肌肉大理石紋等級(jí)的評(píng)定

肉牛大理石紋等級(jí)參照“優(yōu)質(zhì)牛肉系統(tǒng)評(píng)定方法和標(biāo)準(zhǔn)（96-003-04-12）”。對(duì)照大理石紋等級(jí)圖片，確定眼肌橫切面處大理石紋等級(jí)。大理石紋等級(jí)共分7個(gè)等級(jí)：1級(jí)、1.5級(jí)、2級(jí)、2.5級(jí)，3級(jí)、3.5級(jí)和4級(jí)。大理石紋極豐富為1級(jí)，豐富為2級(jí)，少量為3級(jí)，幾乎沒(méi)有為4級(jí)，介于兩級(jí)之間為0.5級(jí)[3]。

1.7 脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA水平檢測(cè)

Trizol兩步法提取脂肪組織總RNA，操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的完整性，測(cè)定RNA純度和濃度（DNA/RNA測(cè)量?jī)x），將各樣品RNA用DEPC水調(diào)至相同濃度，反轉(zhuǎn)錄，制備成cDNA。利用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)Genbank中ADPN序列，設(shè)計(jì)引物(上?；瞪锕こ坦竞铣?如表2。常規(guī)PCR。電泳后用凝膠試劑盒回收，連接到PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，克隆后提取質(zhì)粒，進(jìn)行重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定。將鑒定正確的陽(yáng)性克隆送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 延邊黃牛、草原紅牛育肥階段日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.8 熒光定量RT-PCR方法

將測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)純度及濃度測(cè)定后，用滅菌四餾水分別做梯度稀釋，作為RT-PCR反應(yīng)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)、3個(gè)陰性質(zhì)控（NTC）。PCR體系（25 μl）：ddH2O 16.2 μl；dNTPs Mixture（2.5 mM）2.0 μl；10×Taq-buffer 2.5 μl；上、下游引物（12 pmol/μl）各 1.0 μl、探針（15 pmol/μl）1.0 μl；Ex Taq 酶（1 U/μl）0.3 μl；temperate DNA 1.0 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，ABI PRISM 7000型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）中擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。

表2 ADPN引物與探針

1.9 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析熒光定量測(cè)定的ADPN mRNA拷貝量，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS10.0軟件進(jìn)行分析，One-Way ANOVA（方差分析）組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 肥育階段肉牛肌內(nèi)脂肪沉積量(見(jiàn)表3)。

表3 肥育末期不同品種肉牛優(yōu)質(zhì)切塊肌內(nèi)脂肪含量(%)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果（見(jiàn)表3）顯示，延邊黃牛與草原紅牛22月齡與24月齡眼肉、胸肉、腱子肉、腰肉、上腦肉肌內(nèi)脂肪含量差異均顯著(P＜0.05)，表明，隨著育肥期的延長(zhǎng)，延邊黃牛與草原紅牛肌內(nèi)脂肪含量呈顯著增加趨勢(shì)。

2.2 延邊黃牛和草原紅牛不同肥育時(shí)期ADPN mRNA水平(見(jiàn)表4)

表4 各試驗(yàn)組ADPN mRNA水平

分析結(jié)果顯示（見(jiàn)表4）：從19月齡到22月齡，延邊黃牛脂肪組織中ADPN mRNA水平均隨著育肥月齡的延長(zhǎng)（除第一個(gè)月齡外）有增加的趨勢(shì)(P＜0.05)，育肥期繼續(xù)延長(zhǎng)至24月齡，ADPN mRNA水平又極顯著下降(P＜0.01)；草原紅牛從19月齡到22月齡，其脂肪組織中ADPN mRNA水平均隨著育肥期的延長(zhǎng)而增加(P＜0.05)，育肥期繼續(xù)延長(zhǎng)至24月齡，ADPN mRNA水平極顯著下降(P＜0.01)。

2.3 延邊黃牛和草原紅牛ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋的關(guān)系

表5 肥育末期肉牛肌肉大理石紋等級(jí)

本試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）：24月齡末的延邊黃牛和草原紅牛眼肉脂肪含量均顯著高于22月齡末(P＜0.05)；無(wú)論是延邊黃牛還是草原紅牛，24月齡時(shí)大理石紋均為3級(jí)，22月齡時(shí)肌肉大理石紋均為3.5級(jí)（見(jiàn)表5）。

3 討論

近年來(lái)，研究者運(yùn)用分子生物學(xué)方法對(duì)脂聯(lián)素的生理功能的研究不斷深入。脂聯(lián)素mRNA在豬脂肪細(xì)胞中表達(dá)豐富[4]。Ding（2004）認(rèn)為脂聯(lián)素可能通過(guò)受體在豬的不同組織發(fā)揮生理作用。Sreenivasa等研究結(jié)果提示ADPN在雞的體內(nèi)可能發(fā)揮與哺乳動(dòng)物不一樣的生物學(xué)功能[5]。Fu等（2005）研究表明，經(jīng)基因轉(zhuǎn)染而表達(dá)的脂聯(lián)素通過(guò)自分泌可促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)的聚積[4]。本課題組試驗(yàn)結(jié)果：體外試驗(yàn)提示，新生荷斯坦乳用犢牛脂肪前體細(xì)胞ADPN mRNA上調(diào)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積，但當(dāng)脂質(zhì)蓄積到一定程度時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)類似于人體肥胖時(shí)的脂聯(lián)素低表達(dá)的現(xiàn)象[6]；奶牛的圍產(chǎn)期間，ADPN可通過(guò)激素和代謝中間產(chǎn)物參與脂肪代謝的調(diào)節(jié)，提示ADPN可能是奶牛脂代謝中重要的調(diào)節(jié)因子[7]；延邊黃牛與雜交肉牛脂聯(lián)素的基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量密切相關(guān)，但與遺傳基礎(chǔ)不同的其他肉牛是否具有同樣的結(jié)果，尚需要進(jìn)一步研究[8]。

本試驗(yàn)結(jié)果：延邊黃牛、草原紅牛眼肉脂肪含量24月齡時(shí)顯著高于22月齡(P＜0.05)（見(jiàn)表3）。肌肉大理石紋主要決定于肌內(nèi)脂肪的含量，從表5可見(jiàn)，延邊黃牛、草原紅牛22月齡時(shí)肌肉大理石紋均為3.5級(jí)，24月齡時(shí)大理石紋均為3級(jí)。提示，從22月齡到24月齡內(nèi)，延邊黃牛與草原紅牛的ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋有呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。延邊黃牛、草原紅牛肌內(nèi)脂肪含量從18月齡到22月齡期間增加（P＜0.05），ADPN mRNA水平也呈增加趨勢(shì)（P＜0.05）。提示，在肉牛的育肥前期ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋有正相關(guān)的趨勢(shì)。延邊黃牛、草原紅牛的育肥階段，從18月齡始前4個(gè)月，ADPN mRNA與肌內(nèi)脂肪量均呈正相關(guān)（延邊黃牛r=0.62；P＜0.001，n=9）、（草原紅牛 r=0.78；P＜0.001），而肥育的后2個(gè)月，ADPN mRNA與肌內(nèi)脂肪量均呈負(fù)相關(guān)（延邊黃牛 r=-0.67；P＜0.001，n=9）和（草原紅牛r=-0.81；P＜0.001，n=9）。是脂聯(lián)素基因的表達(dá)量降低上調(diào)了肌內(nèi)脂肪的沉積，還是肌內(nèi)脂肪的沉積上調(diào)了脂聯(lián)素基因表達(dá)的下降尚不明確。但是否提示可以將脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素作為肉牛肌內(nèi)脂肪調(diào)控的一個(gè)后選基因，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于本試驗(yàn)樣本數(shù)少，對(duì)脂聯(lián)素基因表達(dá)與肉牛肌肉大理石紋的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

延邊黃牛、草原紅牛的ADPN mRNA水平在育肥的18月齡始到24月齡末階段，前4個(gè)月與肌內(nèi)脂肪含量均正相關(guān)，后2個(gè)月均呈負(fù)相關(guān)。提示，延邊黃牛與草原紅牛的ADPN mRNA水平與肌肉大理石紋均有相關(guān)性。