周輝吳 煒趙明

細(xì)胞分裂周期蛋白2(cell division cycle 2,Cdc2)又叫細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinases1,CDK1），是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在整個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控中特別是G2至M期起關(guān)鍵作用。G2后期Cdc2激酶與積累的周期蛋白B(cyclin B)結(jié)合形成Cdc2-cyclinB復(fù)合物，也稱有絲分裂促進(jìn)因子(MPF)，推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂M期[1-2]。Cdc2激酶的過度表達(dá)，可使細(xì)胞周期進(jìn)程紊亂，以致細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)、分化，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，形成腫瘤[3]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Cdc2基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，并在骨肉瘤細(xì)胞U2OS中驗(yàn)證其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，旨在利用該報(bào)告基因來篩選新的抗腫瘤藥物，并為研究臨床抗腫瘤藥物的分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 U2OS細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、載體質(zhì)粒pGL3-Basic、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40本科室保留。人血基因組DNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司。DNA片段凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；KOD FX DNA聚合酶、Ligase high酶購(gòu)自TOYOBO；限制性內(nèi)切酶ScaⅠ和XhoⅠ購(gòu)自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；胰蛋白酶、新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；瓊脂粉（Agar）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出粉（Yeast Extract）購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Dual-Luciferase Reporter Assay System）購(gòu)自美國(guó)Promega公司。所用儀器：PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；電泳儀（北京百晶）；凝膠圖像分析儀（法國(guó)Vilber Lourmat公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；多孔板高效閱讀器（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用UCSC基因組瀏覽器查找人Cdc2基因啟動(dòng)子序列。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，確定本實(shí)驗(yàn)研究Cdc2基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度為3 273 bp（-3 198 bp～+75 bp）。并用Primer 5分析啟動(dòng)子序列上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)其兩端引物（PCR引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成）。上游引物：5＇-TGATGAGCTCTTTTAGAAGGAGTCTC?GCTC-3＇，包含Cdc2基因啟動(dòng)子堿基，1個(gè)SacⅠ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，4個(gè)保護(hù)堿基。下游引物：5＇-TAATCTCGAGACCGC?GTCGCTCTCCGCTCA-3＇，包含Cdc2基因啟動(dòng)子互補(bǔ)堿基，1個(gè)XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)，4個(gè)保護(hù)堿基。產(chǎn)物大小3 293 bp。

1.2.2 Cdc2啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增 取正常人外周血5 mL，按照血液基因組DNA提取試劑盒的操作方法，提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，用KOD FX DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，65℃退火30 s，68℃延伸3 min 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3 Cdc2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 采用pGL3-Basic載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化氯化鈣感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑單克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增；用質(zhì)粒抽提試劑盒制備擴(kuò)增pGL3-Basic質(zhì)粒，用紫外分光光度儀測(cè)定純度和濃度。先后用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ對(duì)回收的Cdc2啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳后切膠回收酶切產(chǎn)物。用Ligase high連接酶將酶切回收后的載體片段和目的DNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)，16℃孵育過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆于含有氨芐青霉素抗性的LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)8 h后取少量進(jìn)行菌液PCR，其余的液體繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至14 h，對(duì)菌液PCR顯示陽(yáng)性的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后，雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒，挑取陽(yáng)性樣本測(cè)序。重組質(zhì)粒pGL3-Cdc2-pro?moter和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞后，測(cè)定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報(bào)告基因活性，并將兩者的比值作為衡量Cdc2啟動(dòng)子活性的依據(jù)，pRL-SV40作為內(nèi)參可以消除由于細(xì)胞數(shù)目及轉(zhuǎn)染效率等不同所帶來的組間差異。

1.2.4 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染骨肉瘤U2OS細(xì)胞 將U2OS細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染的前1 d將U2OS細(xì)胞以1×104的密度接種于24孔板并換用無抗生素的含10%胎牛血清培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)到80%。按照Lipofectamine 2000試劑盒操作說明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cdc2基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Cdc2-promoter及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-SV40。另設(shè)一組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pGL3-Basic和內(nèi)參pRL-SV40質(zhì)粒作為對(duì)照組。

1.2.5 Cdc2啟動(dòng)子活性測(cè)定 轉(zhuǎn)染24 h后，每孔細(xì)胞用PBS洗滌2次。按照Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Dual-Luciferase Reporter Assay System）說明書，每孔加入100 μL的PLB（Passive Lysis Buffer）裂解細(xì)胞，于搖床上震搖15 min，收集細(xì)胞裂解液。取20 μL細(xì)胞裂解液，先用多孔板高效閱讀器讀取背景值。每孔加入100 μL的LARⅡ工作液，讀取螢火蟲熒光素酶發(fā)光值。再加入100 μL的Stopamp;GloRReagen（t螢火蟲熒光素酶終止液和海腎熒光素酶的底物），讀取海腎熒光素酶發(fā)光值。2組細(xì)胞同時(shí)檢測(cè)，每組細(xì)胞重復(fù)檢測(cè)3次。以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cdc2啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增 以正常人血細(xì)胞基因組DNA為模板，克隆Cdc2啟動(dòng)子片段，1%瓊脂糖膠電泳可在3 000 bp附近可見單一條帶，見圖1A，與3 273 bp的Cdc2基因啟動(dòng)子大小相符。

2.2 報(bào)告基因pGL3-Cdc2-promoter載體構(gòu)建 膠回收后的Cdc2啟動(dòng)子片段和pGL3-Basic雙酶切后，見圖1B。連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建pGL3-Cdc2-promoter重組質(zhì)粒。對(duì)菌液PCR陽(yáng)性的樣品提質(zhì)粒后，再用SacⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物電泳可在3 000 bp和5 000 bp附近處出現(xiàn)2個(gè)條帶，這與插入的3 273 bp的Cdc2啟動(dòng)子目的片段和4 800 bp的線性pGL3-Basic大小完全一致，見圖2。測(cè)序結(jié)果顯示，Cdc2基因啟動(dòng)子成功插入到pGL3-Basic載體中，見圖3，且未發(fā)現(xiàn)堿基突變。

Figure 1 Electrophoresis of Cdc2 promoter PCR product and digestion of pGL3-Basic plasmids by endonucleases圖1 Cdc2啟動(dòng)子片段的PCR及pGL3-Basic雙酶切電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒的功能鑒定 檢測(cè)到瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40組熒光素酶活性為1.591 5±0.199 8，高于轉(zhuǎn)染pGL3-Basic/pRL-SV40組的熒光素酶活性0.049 9±0.010 4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.346，P＜0.01)。

Figure 2 The digestion verification of recombinant plasmid pGL3-Cdc2-promoter by endonucleases圖2 重組質(zhì)粒pGL3-Cdc2-promoter雙酶切鑒定

3 討論

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，細(xì)胞周期是在一系列細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDKs）和催化亞基周期素（cy?clins）共同調(diào)節(jié)下忠實(shí)而有序地啟動(dòng)和完成的細(xì)胞周期事件。細(xì)胞周期的基本順序是G1-S-G2-M。CyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2作用于G1期并推動(dòng)G1/S進(jìn)程。Cdc2與cyclinB家族蛋白結(jié)合形成MPF是細(xì)胞順利進(jìn)行S期及G2/M轉(zhuǎn)變的必要保障[5]。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，在CDK2敲除的情況下，Cdc2可與cylclinE形成復(fù)合物，代替CDK2的功能，促進(jìn)G1/S的轉(zhuǎn)換[6]。Cdc2對(duì)整個(gè)細(xì)胞分裂進(jìn)程的調(diào)節(jié)起著中心作用。

Figure 3 Sequence peaks of Cdc2 promoter and comparison results of BLAST圖3 Cdc2啟動(dòng)子的測(cè)序峰圖及BLAST比對(duì)結(jié)果

通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、基因足跡分析Cdc2的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn) ATF、Sp1、CCAAT 盒、CDE/CHR、est-2、E2F、cMyb和 IG（E-box）等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[7-8]。它們共同調(diào)節(jié)著Cdc2在不同信號(hào)通路下的表達(dá)。E2F是最早開始研究，也是研究得最為透徹的Cdc2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。CyclinD-CDK4/6激酶復(fù)合體可磷酸化Rb/E2F復(fù)合體中的Rb蛋白，使E2F轉(zhuǎn)錄因子得以釋放出來與Cdc2啟動(dòng)子結(jié)合，從而起始Cdc2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。CyclinD-CDK4/6復(fù)合體受p15、p16、p18、p19、p21等細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白（cyclin-dependent kinese inhibitors,CKI）的負(fù)向調(diào)節(jié)。許多腫瘤細(xì)胞，例如U2OS、HeLa等，p16表達(dá)缺如，導(dǎo)致Cdc2蛋白過度表達(dá)，細(xì)胞周期調(diào)控失衡，細(xì)胞過度增生形成腫瘤[4]。

細(xì)胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。CDKs的表達(dá)及活性的調(diào)控異常是惡性腫瘤的共同特征，這使得CDK蛋白家族成為抗癌藥物極具前景的靶點(diǎn)[9]。Cdc2的過表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞惡性增殖，而且Cdc2的表達(dá)量與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等明顯相關(guān)。已有研究表明，在結(jié)腸癌[10]、肝癌[11]、非小細(xì)胞肺癌[12]、前列腺癌[13]等腫瘤細(xì)胞中都檢測(cè)到Cdc2過表達(dá)。Elangovan等[14]發(fā)現(xiàn)三烯生育酚能通過抑制CDK4和cyclinD1的表達(dá)，抑制Rb的磷酸化，阻礙下游E2F轉(zhuǎn)錄因子與Cdc2啟動(dòng)子的結(jié)合，下調(diào)Cdc2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，阻滯乳腺癌細(xì)胞的分裂增殖，達(dá)到治療乳腺癌的目的。

熒光素酶報(bào)告基因法是目前用于分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控的常用方法。本研究通過將Cdc2基因的啟動(dòng)子序列克隆至含熒光素酶的報(bào)告基因而無啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒PGL3-basic中，并與含海腎熒光素酶的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞U2OS細(xì)胞中，通過檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)量反映啟動(dòng)子序列的活性，間接反映Cdc2基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并驗(yàn)證了其活性。值得注意的是，XhoⅠ對(duì)超螺旋狀態(tài)的pGL3-Basic質(zhì)粒酶切不完全，但是對(duì)線性質(zhì)粒的酶切效果良好。所以筆者在做質(zhì)粒的雙酶切時(shí)，先用SacⅠ將超螺旋質(zhì)粒酶切成為線性質(zhì)粒后再加入XhoⅠ，取得了良好的效果。

[1]Zhao XF,Gartenhaus RB.Phospho-p70S6K and cdc2/cdk1 as ther?apeutic targets for diffuse large B-cell lymphoma[J].Expert Opin Ther Targets,2009,13(9):1085-1093.

[2]Rhind N，Russell P.Signaling pathways that regulate cell division[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2012,4(10),pii:a005942.[doi:10.1101/cshperspect.a005942]

[3]翟德忠,黃強(qiáng).細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶cdc2與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究[J].腫瘤,2006,26(5):489-491.

[4]Sugarman JL,Schonthal AH,Glass CK.Identification of a celltype-specific and E2F-independent mechanism for repression of cdc2 transcription[J].Mol Cell Biol,1995,15(6):3282-3290.

[5]Hu X,Moscinski LC.Cdc2:a monopotent or pluripotent CDK[J]?Cell Prolif,2011,44(3):205-211.

[6]Aleem E,Kiyokawa H,Kaldis P.Cdc2-cyclin E complexes regulate the G1/S phase transition[J].Nat Cell Biol,2005,7(8):831-836.

[7]North S,Espanel X,Bantignies F,et al.Regulation of cdc2 gene ex?pression by the upstream stimulatory factors(USFs)[J].Oncogene,1999,18(11):1945-1955.

[8]Muller GA,Engeland K.The central role of CDE/CHR promoter ele?ments in the regulation of cell cycle-dependent gene transcription[J].FEBS J,2010,277(4):877-893.

[9]Tripathi SK,Singh SK,Singh P,et al.Exploring the selectivity of a ligand complex with CDK2/CDK1:a molecular dynamics simulation approach[J].J Mol Recognit,2012,25(10):504-512.

[10]Oh SM,Kim J,Lee J,et al.Anticancer potential of an ethanol ex?tract of Asiasari radix against HCT-116 human colon cancer cells in vitro[J].Oncol Lett,2013,5(1):305-310.

[11]Liu H,Liang Y,Wang L,et al.In vivo and in vitro suppression of hepatocellular carcinoma by EF24,a curcumin analog[J].PLoS One,2012,7(10):e48075.

[12]Park KI,Park HS,Nagappan A,et al.Induction of the cell cycle ar?rest and apoptosis by flavonoids isolated from Korean Citrus auran?tium L.in non-small-cell lung cancer cells[J].Food Chem,2012,135(4):2728-2735.

[13]Kallakury BV,Sheehan CE,Ambros RA,et al.The prognostic signif?icance of p34cdc2 and cyclin D1 protein expression in prostate ade?nocarcinoma[J].Cancer,1997,80(4):753-763.

[14]Elangovan S,Hsieh TC,Wu JM.Growth inhibition of human MDA-mB-231 breast cancer cells by delta-tocotrienol is associated with loss of cyclin D1/CDK4 expression and accompanying changes in the state of phosphorylation of the retinoblastoma tumor suppressor gene product[J].Anticancer Res,2008,28(5A):2641-2647.