于 洋 趙丹玉 王艷杰 馮曉帆 楊雪峰 張瑞鵬 柳 春

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，遼寧 沈陽 110032)

目前，糖尿病(DM)已成為第三大危害人類健康的全球性慢性疾病。其中胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病基礎(chǔ)〔1〕。IR即胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素的敏感性下降，從而使葡萄糖的利用能力降低。研究證明，組織和細(xì)胞對(duì)胰島素的攝取和利用能力下降與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能不全(ECD)同時(shí)存在〔2〕。細(xì)胞代謝過程會(huì)產(chǎn)生各種活性物質(zhì)，DM脂代謝紊亂時(shí)，氧化系統(tǒng)的作用超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)〔3〕。六味地黃丸(LWDHP)被譽(yù)為“補(bǔ)陰方藥之祖”，具有抗氧化、降糖降脂之功效，臨床應(yīng)用其治療DM取得良好的療效〔4〕。本實(shí)驗(yàn)以軟脂酸(PA)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)建立IR模型，探討LWDHP含藥血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷抗氧化的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國(guó)藥準(zhǔn)字Z19993068);胰島素，PA，噻唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司;DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清，美國(guó) HyClone公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒，二甲基亞砜(DMSO)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;兔抗人還原型輔酶素(NADPH)氧化酶4(NOX4)一抗，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，美國(guó)Proteintech Group公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司;RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司;二甲雙胍(MET)，上海生工生物工程有限公司;總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒，丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 LWDHP含藥血清的制備 52只SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量300～350 g，雌雄各半，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào):SCXK(遼)2010-0001)。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，早晚各喂食1次，換水1次/d，自由飲水進(jìn)食，晝夜自然采光，室溫16℃ ～25℃，相對(duì)濕度60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字法分為兩組，正常對(duì)照組34只，LWDHP中藥組18只。中藥組給予LWDHP粉末水溶液(生藥質(zhì)量濃度為15 g·kg-1·d-1)灌胃，3 ml/次/只，2次/d，正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d。第6天于末次給藥1～2 h后10%水合氯醛腹腔麻醉(1.5 ml/只)，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，56℃滅活30 min，過濾除菌、分裝、封口、-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926 HUVEC(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整密度0.5×105個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μl/孔，分為正常對(duì)照組、模型組、LWDHP治療組(2.5%、5%、10%含藥血清)、MET組，每組6個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞90%生長(zhǎng)融合后，LWDHP治療組換成不同濃度梯度含大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET(終濃度2 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入PA(終濃度為400 μmol/L)孵育1 h后，再加入胰島素(終濃度50 nmol/L)。PA作用細(xì)胞24 h后，加入MTT(5 mg/ml)，20 μl/孔，4 h 后加 DMSO(150 μl/孔)震蕩細(xì)胞15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值(490 nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 總SOD活性和MDA含量檢測(cè) 細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中正常培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組、模型組，5%LWDHP含藥血清治療組、MET組，每組6個(gè)復(fù)孔。LWDHP含藥血清，MET及PA處理細(xì)胞的方法同1.3。細(xì)胞處理后棄去培養(yǎng)基，按1×106個(gè)/ml細(xì)胞加入0.1 ml的RIPA裂解液(含10 μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF)，1 600 r/min離心10 min取上清液，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒的操作步驟檢測(cè)細(xì)胞裂解液中總SOD活性和MDA含量。

1.5 RT-PCR測(cè)定細(xì)胞NOX4 mRNA表達(dá) 將細(xì)胞按5×105個(gè)/ml密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加4 ml培養(yǎng)基，分組同1.4。各組細(xì)胞藥物處理后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，分別測(cè)定OD260和OD280值并計(jì)算其比值以鑒定RNA純度。隨后用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。

β-actin上游引物序列:5'-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3'，下游引物序列:5'-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度153 bp。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40 個(gè)循環(huán)。NOX4 上游引物序列:5'-CAGGAGGGCTGCTGAAGTATCAA-3'，下游引物序列:5'-TGACTGGCTTATTGCTCCGGATA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度303 bp。反應(yīng)條件:退火68℃，30個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以NOX4條帶光密度值和對(duì)應(yīng)的β-actin條帶光密度值的比值表示NOX4 mRNA的表達(dá)量。

1.6 Western印跡測(cè)定細(xì)胞NOX4蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組加藥處理后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度。調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量(40 μg)，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺粒膠(SDS-PAGE)電泳分離，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜。HRP標(biāo)記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，37℃水浴震蕩2 h，DAB顯色，掃描條帶，ImageJ2x軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參，NOX4和GAPDH蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行灰度比值顯示NOX4表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 LWDHP含藥血清對(duì)PA損傷的HUVEC增殖的影響 模型組細(xì)胞的存活率是 60.62%(OD 值0.75±0.04)，與正常對(duì)照組(OD 值1.24±0.05)比較有顯著性差異(P＜0.01)。用不同濃度的LWDHP含藥血清對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)保護(hù)，2.5%含藥血清，HUVEC 的存活率只有 31.67%，OD 值 0.39±0.03;5%、10%含藥血清組和 MET組細(xì)胞存活率分別為 77.46%、130.87%和 102.46%，OD 值分別為 0.96±0.03、1.62±0.02 和1.27±0.11，均明顯高于模型組(P＜0.01)。

2.2 LWDHP含藥血清對(duì)PA損傷的HUVEC總SOD活性的影響 PA損傷的細(xì)胞裂解液中總 SOD活性下降〔(48.42±4.06)U/ml〕，與正常對(duì)照組〔(67.41±4.08)U/ml〕比較差異顯著(P＜0.01)。5%LWDHP 含藥血清〔(63.46±2.67)U/ml〕和MET〔(64.27±3.24)U/ml〕能顯著增加 PA 損傷 HUVEC 的總SOD活性，其改善作用與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.3 LWDHP含藥血清對(duì)PA損傷的HUVEC MDA含量的影響 PA損傷的細(xì)胞裂解液中脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA含量〔(0.748±0.048)μmol/L〕增高，與正常對(duì)照組 〔(0.346±0.031)μmol/L〕比較差異顯著(P＜0.01)。5%LWDHP 含藥血清〔(0.576±0.016)μmol/L〕和 MET〔(0.540±0.022)μmol/L〕能顯著降低MDA含量，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.4 各組NOX4 mRNA的表達(dá) 與正常對(duì)照組(0.545±0.000 4)比較，PA 組細(xì)胞內(nèi) NOX4 mRNA 的表達(dá)量(0.823±0.000 9)升高(P＜0.01)。與 PA 組比較，LWDHP 組(0.256±0.000 7)和 MET 組(0.545±0.000 7)細(xì)胞內(nèi) NOX4 mRNA 表達(dá)量下降(P＜0.01)。見圖1。

2.5 各組 NOX4蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組(0.099±0.000 4)比較，PA組細(xì)胞內(nèi) NOX4蛋白的表達(dá)量(0.166±0.000 9)顯著升高(P＜0.01)。LWDHP 組(0.117±0.000 5)和MET組(0.139±0.000 5)與PA組比較，細(xì)胞內(nèi)NOX4蛋白表達(dá)量均下降(P＜0.01)。見圖2。

圖1 各組HUVEC內(nèi)NOX4 mRNA的表達(dá)比較

圖2 各組HUVEC內(nèi)NOX4蛋白表達(dá)的比較

3 討論

DM是一種與遺傳因素和多種環(huán)境因素相關(guān)的以慢性高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征，目前認(rèn)為DM的病理發(fā)病基礎(chǔ)之一是IR。IR是指胰島素作用的靶器官如肝臟、肌肉和脂肪組織等對(duì)一定量的胰島素作用敏感性下降，生物學(xué)反應(yīng)低于正常水平，從而使葡萄糖利用減少，引起血糖水平升高。另外，IR會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酸生成增多，沉積在血管內(nèi)皮上，引起內(nèi)皮細(xì)胞(EC)凋亡，導(dǎo)致 ECD〔5〕。

正常的EC不僅是血液和血管平滑肌之間的半透屏障，而且還是一個(gè)非?；钴S的代謝和內(nèi)分泌器官。細(xì)胞在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生很多的高活性物質(zhì)，其中的氧自由基作用于膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，最重要的終產(chǎn)物之一為MDA，可通過測(cè)定MDA來了解細(xì)胞受損的程度〔6〕。體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生有多種酶參與，其中NOX目前被認(rèn)為是活性氧生成的關(guān)鍵酶，在NOX家族中，血管EC主要表達(dá)NOX4〔7〕。同時(shí)體內(nèi)還存在抗氧化系統(tǒng)，最重要的是SOD，SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫和氧氣，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。如果氧自由基和抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，氧自由基過度生成或清除減少，SOD的抗氧化能力下降，導(dǎo)致MDA顯著增加，細(xì)胞功能進(jìn)一步受損〔8〕。本實(shí)驗(yàn)說明細(xì)胞受損嚴(yán)重，膜的完整性遭到破壞，意味著PA可能通過NOX4途徑誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生了氧化損傷。

近年研究表明，中醫(yī)藥在保護(hù)EC、預(yù)防EC損傷方面具有較為理想的調(diào)控效果，尤其是復(fù)方治療更具有優(yōu)勢(shì)〔9〕。中醫(yī)認(rèn)為氣虛陰虧是DM發(fā)生的基本病因病機(jī)，而LWDHP是滋補(bǔ)氣陰兩虛的傳統(tǒng)名方，臨床上用以治療DM顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的LWDHP含藥血清對(duì)PA損傷的EC進(jìn)行預(yù)保護(hù)，結(jié)果說明血清濃度太低，細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)比較差。大鼠血清本身就有刺激細(xì)胞增殖的效應(yīng)，會(huì)掩蓋PA造模的效果，因此選定5%LWDHP含藥血清作為最佳治療濃度。

所以用5%LWDHP含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)后，能顯著增加PA損傷HUVEC的總SOD活性，降低MDA含量，同時(shí)能下調(diào)受損細(xì)胞的NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)，證明LWDHP能降低PA對(duì)HUVEC的氧化損傷程度，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，改善受損的EC狀態(tài)，提示LWDHP可能通過抑制NOX4的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮它的抗氧化功效。

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