趙唯賢 郭梅珍 王保偉 劉建濤 李高申 李宜培 劉俊玲

(河南醫(yī)學高等?？茖W校，河南 鄭州 451141)

阿爾茨海默病(AD)早期常表現(xiàn)為典型的抑郁癥狀和對日常興趣的喪失，記憶力減退，智力下降，意念消極，性格改變等〔1，2〕。本研究從疏肝立法，通過對大鼠海馬及前額葉超微結構的觀察，探討疏肝理氣方劑對改善AD病指標的相關性，旨在為AD臨床提供治療依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級4～5個月SD雄性大鼠，體質量(250±20)g，河南省實驗動物中心提供，合格證號:SCXX(豫)2010-0002。

1.1.2 干預藥物

1.1.2.1 中藥制備 逍遙散(組成:柴胡、當歸、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷)各藥間質量按 10 ∶10 ∶10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1配比，由我院科研處按中藥煎劑制備流程自行制作。于每日用藥前2 h開始即時配制，最后將藥液濃縮至2 g/ml，備用。

1.1.2.2 西藥制備 將奧拉西坦藥粉(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司提供，400 mg/粒，批號:05110703)在每日用藥前30 min用常溫蒸餾水稀釋成濃度為150 mg/ml的奧拉西坦溶液，備用。

1.1.3 試劑設備 D-半乳糖 (D-gal，Genview公司產，北京鼎國昌盛生物技術有限公司分裝，批號:22L10133);β淀粉樣多肽 (Aβ)1～42peptide(北京博奧森生物技術有限公司提供，批號:990901);潔凈工作臺 (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);大腦立體定位儀 (安徽淮北正華單臂立體定位儀);超薄切片機 (型號 LKBV)、透射電鏡 (日本電子，JEM-1400)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 適應性喂養(yǎng)3 d，6只/籠，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00 ～18∶00)，室溫 22℃ ～24℃，濕度 30% ～ 40%，自由飲水進食。喂以普通大鼠顆粒飼料(河南省實驗動物中心提供)。使用苦味酸染色對每只大鼠進行標號。通過水迷宮實驗，留用成績最優(yōu)者作為正式實驗用大鼠，并隨機分為生理組、模型組、西藥組、中藥組，每組10只。

1.2.2 試劑配制 ①事先將1 mg Aβ1～42加入200 μl生理鹽水(5 μg/ul)，震蕩混勻使其充分溶解，用封口膜密封，放入37℃溫箱孵育1 w，孵育后可放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?②D-gal用生理鹽水稀釋成10 g/L溶液，在使用前30 min臨時配制。

1.2.3 模型制作 模型、西藥、中藥三組采用D-gal腹腔注射和 Aβ1～42peptide雙側海馬注射聯(lián)合造?！?〕:大鼠經10%水合氯醛 (0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定在大腦立體定位儀上，剪短頭部毛發(fā)，切開頭皮暴露頭骨。以前囟為基點，將微量注射器針頭對準前囟中央，針頭后移4 mm，左右各移2 mm分別為左右側海馬位置。鉆開頭骨，用微量注射器針頭進入大腦1.6 mm到達海馬組織。每側海馬組織在10 min內緩慢注射10 μg(2 μl)孵育好的A-B溶液，每側注射后將針頭留置10 min，以免溶液外溢。注射完畢用骨蠟封閉針孔，縫皮、消毒，腹腔注射20萬IU青霉素以防感染。生理組僅用等體積滅菌生理鹽水如前各組操作象征性造模。

1.2.4 藥物干預 各組均在造模完成后的次日開始。生理、模型組分別采用生理鹽水0.5 ml/100 g灌胃;西藥、中藥組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃，劑量均為0.5 ml/100 g。四組均連續(xù)灌胃干預28 d，灌胃1次/d。

1.2.5 標本取材 干預結束后，大鼠以0.4 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉液腹腔注射麻醉，斷頭處死，在滴有4℃ 4%戊二醛固定液的蠟板上 (蠟板放置在冰盒上)，迅速用刀片從正中剖開大腦，取出海馬CA1區(qū)及前額葉組織，同時用注射器抽取4℃ 4%戊二醛固定液反復沖洗分離的組織1～2 min，使其固定，再迅速切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，分組標記，放入裝有4℃ 4%戊二醛固定液的小玻璃容器中，4℃保存、待檢。

2 結果

電鏡圖片顯示:生理組大鼠前額葉皮質(PFC)神經元細胞核居中，核仁明顯，粗面內質網在胞質聚集成片，微管、微絲排列整齊，模型組大鼠PFC神經元可見大量線粒體腫脹、其嵴消失，粗面內質網擴張，核膜皺褶，微管、微絲排列紊亂、纏結;突觸間隙明顯變寬、突觸后膜致密物(PSD)厚度明顯變薄。中藥組及西藥組大鼠PFC神經元微量線粒體腫脹，少量粗面內質網擴張，微管、微絲排列較有序。與模型組大鼠比較，中藥組大鼠PFC神經元突觸間隙明顯變窄、PSD厚度明顯變厚。見圖1。

圖1 電鏡觀察各組海馬CA1區(qū)、額葉區(qū)超微結構

3 討論

AD的病理學特征是在腦內形成神經原纖維纏結和大量的老年斑等，神經原纖維纏結的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白tau，老年斑的主要成分是Aβ〔4〕。在老年斑形成之前，有神經毒性的可溶性Aβ寡聚體可造成腦內突觸損害〔5〕。線粒體等細胞器及突觸等超微結構變化也是AD認知功能障礙的重要病理結構基礎〔6～8〕。

正常情況下Aβ的產生和降解保持平衡，其從可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉變是AD發(fā)病的關鍵。Aβ的分子構型與Aβ神經毒性關系密切，β片層結構可促進Aβ聚集成不溶性纖維，形成極難溶的沉淀(斑塊)，導致AD發(fā)生〔9〕。

學習記憶過程涉及多個腦區(qū)的功能活動，在人類，PFC與情緒之間有密切關系，臨床和神經成像研究結果顯示，PFC損傷對情緒行為會造成一定的影響〔10〕。PFC是大腦新皮質中起重要聯(lián)絡作用的一個區(qū)域，參與了學習和記憶的過程〔11〕。有學者推測PFC在前瞻性記憶的編碼、保持、提取和執(zhí)行的過程中可能起著重要作用〔12〕。有研究顯示，小鼠模型學習記憶能力下降同時出現(xiàn)海馬CA1區(qū)突觸前后膜不清晰，間隙消失，小泡數(shù)目減少，部分線粒體腫脹變性，嵴斷裂，推測這些超微結構的變化可能是早期學習記憶行為障礙的形態(tài)結構基礎之一〔13〕。

本研究顯示，逍遙散對AD模型大鼠CA1區(qū)及PFC神經元損傷的線粒體、粗面內質網，微管、微絲的排列紊亂有一定的調整作用，能降低AD模型腦內Aβ水平，進而減低了Aβ對大鼠海馬的毒性作用。文獻〔14〕報道，突觸間隙變窄，PSD變厚等均能增強突觸傳遞效能。逍遙散能使AD模型大鼠突觸間隙變窄，PSD厚度變厚，增強突觸傳遞效能，改善AD模型大鼠受損的學習記憶能力。

AD屬中醫(yī)的“呆病”、“郁證”范疇，中醫(yī)對其病因有獨特的理論，認為是一種全身性疾病，病位在腦，但與五臟具有關系，其中腎、脾、心、肝四臟關系最為密切。七情失調是本病形成的重要原因，當今社會中如精神創(chuàng)傷，情緒壓抑;或獨身居住、子女不孝;或離異喪偶、孤獨寂寞等都可作為現(xiàn)場情志失調的重要因素。而肝主疏泄，調暢情志，對情志的調節(jié)作用至關重要。早期AD常表現(xiàn)為典型抑郁癥狀和對日?；顒拥呐d趣喪失。AD的發(fā)病率逐年上升，嚴重危害老年人的身心健康和生活質量，并給家庭和社會帶來沉重的負擔，已成為嚴重的社會問題，應引起政府和醫(yī)學界的高度關注，加強這方面的研究。

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