崔慧霞，張文陸

（遼寧醫(yī)學(xué)院1.護(hù)理學(xué)院基護(hù)教研室；2.附屬第一醫(yī)院綜合八病區(qū)，遼寧 錦州 121001）

腫瘤生物治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四大治療模式。其中，樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)。DC是功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），可將抗原信息以主要組織相容性復(fù)合體（major histocompability complex，MHC）-抗原肽復(fù)合體的形式提呈給初始T淋巴細(xì)胞，從而誘導(dǎo)其成為特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），因此DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者［1］。不成熟的DC抗原提呈能力較弱，成熟的DC才具有強(qiáng)大的抗原提呈能力。因此，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC中常加入某些刺激劑以促進(jìn)其成熟。為了促進(jìn)DC對(duì)特異性抗原的提呈，在培養(yǎng)的過(guò)程中常加入抗原蛋白或編碼蛋白的腺病毒，而這2種刺激劑中的哪一種更能促進(jìn)DC的成熟，已有文獻(xiàn)說(shuō)法不一，故本研究擬比較腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負(fù)載在促進(jìn)DC成熟中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮外周血來(lái)源于健康志愿者；表達(dá)人乳腺珠蛋白（mammaglobin＆x100ccf;A，MGBA）的重組腺病毒Ad＆x100ccf;MGBA和空腺病毒Ad＆x100ccf;null為本研究室構(gòu)建；人重組乳腺珠蛋白購(gòu)自臺(tái)灣Abnova公司；重組人粒單核細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte＆x100ccf;macrophage colony＆x100ccf;stimulating factor，GM＆x100ccf;CSF）、重組人腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor＆x100ccf;α，TNF＆x100ccf;α）、重組人白細(xì)胞介素4（interleukin＆x100ccf;4，IL＆x100ccf;4）均購(gòu)自廈門(mén)特寶公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司；IL＆x100ccf;12p70ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自達(dá)科為生物科技有限公司；藻紅蛋白（phycoerethrin，PE）標(biāo)記的鼠抗人CD80、別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的鼠抗人CD83、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的鼠抗人CD86及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：從健康志愿者的外周血中，用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基于37Ⅴ、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)2 h，非貼壁細(xì)胞棄除，貼壁細(xì)胞用含1 000 IU/mL GM＆x100ccf;CSF和500 IU/mL IL＆x100ccf;4的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3日換液。將體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC共分成4組：（1）DC組：為對(duì)照組，常規(guī)培養(yǎng)；（2）MGBAp DC組：在培養(yǎng)第4天添加40 μg/mL純化的人MGBAp；（3）Ad＆x100ccf;null DC組：在培養(yǎng)第5天按MOI200加入腺病毒空載體Ad＆x100ccf;null；（4）Ad＆x100ccf;MGBA DC組：在培養(yǎng)第5天按MOI200加入重組腺病毒Ad＆x100ccf;MGBA。

1.2.2 形態(tài)觀察：上述各組DC培養(yǎng)至第7天，用倒置相差顯微鏡觀察各組DC的形態(tài)。并收集各組DC用于后續(xù)的研究。

1.2.3 各組DC表型的檢測(cè)：收集培養(yǎng)至第7天的各組DC，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，每個(gè)EP管中加入0.5 mL細(xì)胞懸液，分別加入PE標(biāo)記的CD80、APC標(biāo)記的CD83、FITC標(biāo)記的CD86及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，4避光孵育30～40 min，PBS洗滌2次，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞后于流式細(xì)胞儀中上機(jī)分析。

1.2.4 各組DC細(xì)胞上清中IL＆x100ccf;12的表達(dá)：檢測(cè)各組DC上清中IL＆x100ccf;12的表達(dá)，具體按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各組的OD值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出IL＆x100ccf;12的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染與蛋白負(fù)載對(duì)DC形態(tài)的影響

用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)7 d的DC，結(jié)果如圖1所示：與未處理組相比，用2種腺病毒轉(zhuǎn)染組DC以及蛋白添加組DC均出現(xiàn)了典型的形態(tài)變化：細(xì)胞體積增大，外形不規(guī)則，且有典型的樹(shù)突狀突起；而未作任何處理的DC雖然體積也較以前增大，但典型的突起較少。提示腺病毒轉(zhuǎn)染及蛋白負(fù)載均能促進(jìn)DC形態(tài)上的成熟。

圖1 相差顯微鏡下培養(yǎng)7 d的D C的形態(tài)特點(diǎn)×400

2.2 腺病毒轉(zhuǎn)染與蛋白負(fù)載對(duì)DC表型的影響

如圖2、3所示：與普通DC相比，病毒轉(zhuǎn)染組與蛋白負(fù)載組DC表面標(biāo)記CD80、CD83和CD86均上調(diào)，說(shuō)明腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負(fù)載均能能促進(jìn)DC表型的成熟；而雖然2個(gè)病毒轉(zhuǎn)染組與蛋白負(fù)載組之間在CD86的表達(dá)上無(wú)差別，但在CD80和CD83的表達(dá)上，腺病毒轉(zhuǎn)染組，尤其是Ad＆x100ccf;MGBA DCs組均高于蛋白轉(zhuǎn)染組，說(shuō)明腺病毒轉(zhuǎn)染比蛋白負(fù)載更能促進(jìn)DC表型的成熟。值得注意的是，兩腺病毒轉(zhuǎn)染組，即Ad＆x100ccf;null DC組和Ad＆x100ccf;MGBA DC組間并無(wú)顯著差別。

2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染與蛋白負(fù)載對(duì)DC IL＆x100ccf;12分泌的影響

如圖4所示：普通DC組IL＆x100ccf;12的分泌顯著低于其他3組DC，提示病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負(fù)載DC均能有效刺激DC分泌IL＆x100ccf;12；蛋白負(fù)載與病毒轉(zhuǎn)染間雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從平均值上分析，腺病毒轉(zhuǎn)染組，尤其是Ad＆x100ccf;MGBA轉(zhuǎn)染組的IL＆x100ccf;12的分泌高于蛋白負(fù)載組。同DC表型結(jié)果一樣，2組腺病毒轉(zhuǎn)染組之間在IL＆x100ccf;12的分泌上也無(wú)顯著差別。

圖2 腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)D C表型的影響

圖3 腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)D C表型影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖4 腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)D C IL＆x100ccf;12分泌的影響

3 討論

DC的主要功能是抗原提呈作用，可將抗原信息遞呈給T淋巴細(xì)胞并將其激活，從而啟動(dòng)機(jī)體的細(xì)胞免疫。然而DC的這種功能是隨著其成熟而逐漸增強(qiáng)的。不成熟DC體積小，沒(méi)有或有很少的突起，此時(shí)抗原攝取能力較強(qiáng)，而提呈能力較弱；隨著DC的成熟，其抗原提呈能力越來(lái)越強(qiáng)，在形態(tài)上也出現(xiàn)了明顯的變化，表現(xiàn)為體積增大并出現(xiàn)典型的突起，即毛刺樣外觀［1，2］。DC可以從人外周血單核細(xì)胞中進(jìn)行體外分離誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過(guò)程中可加入抗原信息誘導(dǎo)其對(duì)特異性抗原的提呈，抗原蛋白負(fù)載DC和編碼抗原的腺病毒轉(zhuǎn)染DC是常用的2種方法［2，4］，而究竟這2種方法中的哪一種更能促進(jìn)DC的成熟，目前仍有爭(zhēng)議，因此本研究對(duì)這2種方法進(jìn)行了比較。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負(fù)載均能促進(jìn)DC形態(tài)上的成熟，即均出現(xiàn)了典型的毛刺樣外觀，而未加任何處理的DC毛刺則較少（圖1）。

DC激活初始T淋巴細(xì)胞需要兩者表面共刺激分子的參與［5］。CD80、CD83和CD86是DC表面表達(dá)的主要共刺激分子，且其表達(dá)隨著DC的成熟而逐漸上調(diào)。其中，CD83被認(rèn)為是DC成熟的標(biāo)記分子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與普通DC組相比，2種病毒轉(zhuǎn)染DC組和蛋白負(fù)載組均促進(jìn)了這3種共刺激分子的表達(dá)，且病毒轉(zhuǎn)染組在CD80和CD83的表達(dá)上要優(yōu)于蛋白負(fù)載組（圖2、3）。

IL＆x100ccf;12不僅有利于T細(xì)胞的激活，而且能促使Th細(xì)胞向Th1方向分化，從而有利于細(xì)胞免疫［6］。因此，研究中常監(jiān)測(cè)IL＆x100ccf;12的表達(dá)來(lái)判斷DC在免疫調(diào)節(jié)中的作用。本研究結(jié)果顯示，2組腺病毒轉(zhuǎn)染組和蛋白負(fù)載組IL＆x100ccf;12的表達(dá)均顯著高于普通DC組，雖然統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯著差別，但從均值上分析，2組腺病毒轉(zhuǎn)染組的IL＆x100ccf;12的分泌量高于蛋白負(fù)載組。

無(wú)論是腺病毒轉(zhuǎn)染還是外來(lái)蛋白刺激，DC最終都是將蛋白裂解成小分子的多肽，再與MHC分子結(jié)合后表達(dá)在細(xì)胞表面供T細(xì)胞識(shí)別。因此，對(duì)DC而言外來(lái)的腺病毒和蛋白都是異己成分從而被其提呈并促進(jìn)其成熟。但腺病毒轉(zhuǎn)染能夠在DC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)活性的蛋白，從而持續(xù)地刺激DC，促進(jìn)其對(duì)抗原的提呈，那么是腺病毒本身還是表達(dá)的活性蛋白促進(jìn)了DC的成熟呢？本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染腺病毒的2組DC，尤其是表達(dá)MGBA的重組腺病毒轉(zhuǎn)染組，無(wú)論是在共刺激分子表達(dá)上還是IL＆x100ccf;12的分泌上均高于蛋白負(fù)載組，但2組腺病毒轉(zhuǎn)染組間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；仡櫸墨I(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于此方面的機(jī)制尚未完全闡明，有的研究認(rèn)為是腺病毒本身的殼體成份——五位體刺激DC致使其成熟；也有研究認(rèn)為腺病毒進(jìn)入DC細(xì)胞后再進(jìn)入細(xì)胞核起到了類(lèi)似于轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而促進(jìn)一大批分子的表達(dá)，其中就包括上述共刺激分子和IL＆x100ccf;12；在這2種機(jī)制中均是腺病毒本身的作用促進(jìn)DC的成熟，而與其是否表達(dá)目的基因無(wú)關(guān)［7］?？傊?，腺病毒轉(zhuǎn)染較蛋白負(fù)載更能促進(jìn)DC的成熟。

綜上所述，腺病毒轉(zhuǎn)染和蛋白負(fù)載均能夠促進(jìn)DC的成熟，能夠促進(jìn)DC共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)IL＆x100ccf;12的分泌，然而腺病毒轉(zhuǎn)染比蛋白負(fù)載更能促進(jìn)DC的成熟。

［1］崔慧霞，李妍，祁馨卉，等.腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（5）：412-415.

［2］Peng W，Zhao G，Ma Y，et al.Dendritic cells transfected with PEG10 recombinant adenovirus elicit anti＆x100ccf;tumor immune response in vitro and in vivo［J］.Vaccine，2011，29（18）：3501-3506.

［3］Wintermeyer P，Gehring S，Eken A，et al.Generation of cellular immune responses to HCV NS5 protein through in vivo activation of dendritic cells［J］.J Viral Hepat，2010，17（10）：705-713.

［4］Chen JH，Yu YS，Chen XH，et al.Enhancement of CTLs induced by DCs loaded with ubiquitinated hepatitis B virus core antigen［J］.World J Gastroenterol，2012，18（12）：1319-1327.

［5］姜娜，潘蕾，李媛，等.慢性丙型肝炎患者抗病毒治療前后外周血樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子的變化及初步分析［J］.臨床肝膽病雜志，2012，28（6）：446-449.

［6］Aline F，Brand D，Pierre J，et al.Dendritic cells loaded with HIV＆x100ccf;1 p24 proteins adsorbed on surfactant＆x100ccf;free anionic PLA nanoparticles induce enhanced cellular immune responses against HIV＆x100ccf;1 after vaccination［J］.Vaccine，2009，27（38）：5284-5291.

［7］Philpott NJ，Nociari M，Elkon KB，et al.Adenovirus＆x100ccf; induced maturation of dendritic cells through a PI3 kinase＆x100ccf;mediated TNF＆x100ccf;a induction pathway［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（16）：6200-6205.