姜紅堃，郭燕平，李雷，姜紅，白英龍

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110003；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

常染色體顯性遺傳性多囊腎（autosomal domi?nant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種常見的遺傳性腎病，發(fā)生率為活產(chǎn)新生兒的0.1%～0.25%，是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病因之一［1］。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種基因表達(dá)及蛋白質(zhì)功能異常，迄今尚未明確。腎小管分化增生異常是腎囊性病變的主要原因之一［1～3］。人類TBX1基因（Gene ID：6899）定位于22q11.21，為染色體22q11.2微缺失中重要基因［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胚胎腎發(fā)育過(guò)程中TBX1在腎小管中高表達(dá)，發(fā)育成熟后表達(dá)微弱；而急性腎小管損傷時(shí)表達(dá)再次升高，提示該基因可能與腎小管發(fā)育及損傷修復(fù)密切相關(guān)［5］。本研究擬通過(guò)檢測(cè)ADPKD患者多囊腎組織TBX1 mRNA及蛋白表達(dá)，探討TBX1基因在ADPKD發(fā)病中的潛在機(jī)制，為產(chǎn)前診斷及遺傳干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

多囊腎組織標(biāo)本11例，來(lái)自本院2009年至2013年明確診斷為ADPKD患者并經(jīng)手術(shù)切除的多囊腎組織，男7例，女 4例，年齡（43±5.3）歲。對(duì)照組腎組織標(biāo)本7例，來(lái)自本院2010年至2013年外科切除的正常腎組織，男4例，女3例，年齡（46±3.5）歲。所留取腎組織部分置于經(jīng)焦炭酸二乙酯（pyro carbonic acid diethyl ester，DEPC）處理過(guò)的EP管中，馬上轉(zhuǎn)移至-80冰箱保存待檢；部分置于多聚甲醛溶液（4 g/L）中固定、包埋。本研究的標(biāo)本使用均經(jīng)受試對(duì)象知情并簽字同意，經(jīng)本院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT＆x100ccf;PCR）檢測(cè)腎組織TBX1 mRNA表達(dá)

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成：TBX1：上游5′＆x100ccf;ACGACAACGGCCACATTATTC ＆x100ccf; 3′，下游5′＆x100ccf; CCTCGGCATATTTCTCGCTATCT＆x100ccf;3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度102 bp。內(nèi)參β＆x100ccf;actin：上游5′＆x100ccf; GCCCTGGATTTTGAGAATGA ＆x100ccf;3′，下游5′＆x100ccf; ATGCCAGCAGATTCCATACC ＆x100ccf;3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度155 bp。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成：利用Trizol RNA抽提試劑盒提取RNA（美國(guó)Invitrogen公司），經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度（A260/280）比值，獲得RNA濃度和純度，并經(jīng)電泳檢測(cè)RNA分子完整性。高速低溫離心機(jī)由美國(guó)Beckman公司提供；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物有限責(zé)任公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，反應(yīng)總體積為20 L，反應(yīng)條件為：4260 min，995 min，45 min。cDNA置于-20冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qPCR反應(yīng)：采用SYBR Green PCR Master mix（美國(guó)Applied Biosystems公司）染料法進(jìn)行TBX1基因qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：cDNA 1.0 L，2×SYBR Green PCR Master mix 25 L，引物（上下游引物的終濃度各為900 nmol/L）2.0 L，ddH2O 22.0 L。反應(yīng)條件：50°C 2 min → 95°C 10 min →（92°C 15 s→ 56.5°C 1 min）×40個(gè)循環(huán)。以β＆x100ccf;actin為內(nèi)參，校正每個(gè)樣本的Ct，采用thermal cycler軟件包計(jì)算Ct值，以2-計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀（7500型）由美國(guó)Applied Biosystems公司提供。

1.3 Western blot檢測(cè)腎組織TBX1蛋白表達(dá)

1.3.1 腎組織總蛋白的提?。喝±鋬鰝溆玫哪I組織100 mg，加入1 mL蛋白裂解液，于冰上超聲波粉碎機(jī)下將組織粉碎，電動(dòng)勻漿，離心后取上清；按照蛋白抽提試劑盒（美國(guó)Active Motif公司）使用說(shuō)明進(jìn)行蛋白抽提，應(yīng)用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 電泳及轉(zhuǎn)膜：將40 μg蛋白抽提物加樣于十二烷基硫酸鈉＆x100ccf;聚丙烯酰胺凝膠中電泳4 h，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國(guó)Amersham公司）。

1.3.3 雜交及顯色：取下PVDF膜，脫脂奶（50 g/L）封閉膜1 h，加入山羊源性TBX1或β＆x100ccf;actin抗體（1∶1 000稀釋，美國(guó)Santa Cruz公司），室溫孵育1 h。TBST洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體（1∶1 000稀釋，美國(guó)Santa Cruz公司），室溫孵育1 h。TBST洗滌后加入ECL顯色試劑（美國(guó)Amersham公司），曝光于Kodak膠片。應(yīng)用凝膠圖像掃描儀（美國(guó)gene公司）進(jìn)行定量分析。

1.4 免疫組織化學(xué)分析檢測(cè)腎組織TBX1蛋白表達(dá)

將新鮮腎組織放入多聚甲醛溶液（4 g/L）中固定24 h，常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，加入山羊源性TBX1抗體（1∶200稀釋，美國(guó)Santa Cruz公司），37孵育1～2 h，加入兔抗羊IgG抗體（1∶200稀釋，美國(guó)Santa Cruz公司），37濕盒中孵育30 min，用DAB顯色液進(jìn)行顯色，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)染色結(jié)果，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 qRT＆x100ccf;PCR檢測(cè)分析結(jié)果

qRT＆x100ccf;PCR結(jié)果表明ADPKD多囊腎腎組織TBX1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.582，P=0.000，表1）。

2.2 Western blot檢測(cè)分析結(jié)果

Western blot結(jié)果表明ADPKD多囊腎腎組織TBX1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.625，P=0.000，表1，圖1）。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析結(jié)果

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明TBX1在對(duì)照組腎組織的腎小管上皮細(xì)胞中呈微量表達(dá)；而在多囊腎囊腫組織上皮細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，腎囊腫組織中可見腎小管囊性擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維化（圖2）。

圖1 Westernblot檢測(cè)多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1蛋白表達(dá)Fig.1 TBX1 protein expression was assayed by Western blot

3 討論

多囊腎病是最常見的遺傳性腎臟疾病之一，分為常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳，其中ADPKD較多見。ADPKD生后即已存在，但多于40～50歲才出現(xiàn)癥狀，故又稱成人型多囊腎［6］。ADPKD臨床表現(xiàn)為腰痛、高血壓、尿路感染、血尿及腎結(jié)石，最終發(fā)展為腎功能衰竭，約占終末期腎衰病因的5%～10%。此外常合并肝、胰、脾、松果體、精囊、肺等腎外的多器官囊腫，ADPKD腎臟有多個(gè)囊腫形成并進(jìn)行性增大［7］。本實(shí)驗(yàn)在ADPKD患者腎囊腫組織中可見腎小管囊性擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維化，囊間腎單位萎縮，為典型多囊腎病理表現(xiàn)。

表1 多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1 mR NA及蛋白表達(dá)水平比較（±s）Tab.1 Expression of TBX1 mRNA or protein level in kidney tissues of the two groups（±s）

表1 多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1 mR NA及蛋白表達(dá)水平比較（±s）Tab.1 Expression of TBX1 mRNA or protein level in kidney tissues of the two groups（±s）

Group n Age（years） TBX1 mRNA TBX1 protein Control 7 46±3.5 1.00±0.02 1.00±0.06 ADPKD 11 43±5.3 12.36±1.15 17.18±2.53

圖2 免疫組化檢測(cè)多囊腎組與對(duì)照組腎組織TBX1蛋白表達(dá) bar=20μmFig.2 TBX1 protein expression was assayed by Immunohistochemistry bar=20μ

ADPKD腎組織囊腫發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制基本相同，主要包括：腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度增生及異常分化；細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及趨化因子等物質(zhì)的增多，導(dǎo)致非感染性腎間質(zhì)纖維化；細(xì)胞外基質(zhì)低分子量糖蛋白、纖維蛋白及型膠原蛋白增多，導(dǎo)致基膜順應(yīng)性改變，囊腫內(nèi)液體異常積聚，腎小管囊腫形成并進(jìn)行性增大［2］。研究表明，的異常分泌及其受體高表達(dá)可以促進(jìn)ADPKD腎組織囊的產(chǎn)生及其相關(guān)信號(hào)分子可能成為ADPKD的生物標(biāo)識(shí)物及治療靶標(biāo)［8］。體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，RAGE基因功能被阻滯后可降低ADPKD模型鼠多囊腎組織囊的發(fā)生及擴(kuò)大，病變腎臟體積及重量明顯降低，尿素氮及肌酐水平逐漸降低［9］。Wnt7a、Wnt7b及基因過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致腎囊性病變的發(fā)生及增殖［10，11］。囊性腎病模型小鼠胚胎腎組織96表達(dá)明顯異常［12］。

人類TBX1基因是T＆x100ccf;box轉(zhuǎn)錄因子家族成員，后者在種系發(fā)生及進(jìn)化過(guò)程中趨于保守，成員均包含一個(gè)相同的DNA結(jié)合域，即T＆x100ccf;box。TBX1基因是已知在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，為調(diào)控咽弓、動(dòng)脈弓、心臟流出道及間隔正常形成的關(guān)鍵基因，參與心臟、耳、甲狀腺、胸腺、牙齒等多種組織和器官的發(fā)育過(guò)程，在精神疾病發(fā)病中亦扮演一定角色［13～19］。目前國(guó)內(nèi)外圍繞TBX1基因的研究多集中于其與心臟畸形的關(guān)系，而對(duì)于該基因與腎臟發(fā)育與疾病的研究較少。研究證實(shí)缺乏Shh基因的小鼠中，TBX1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)［20］；而Shh基因缺失可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠后腎間充質(zhì)發(fā)育異常，將脊索及底板的Shh基因滅活后可導(dǎo)致腎臟融合出現(xiàn)蹄形腎［21］。另有研究表明，TBX1基因在胚鼠腎臟發(fā)育中呈波動(dòng)表達(dá)，其蛋白與HOXD10相互作用參與腎臟發(fā)育［22］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎小管損傷模型鼠中，腎小管上皮細(xì)胞TBX1基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示該基因可能參與腎小管上皮的損傷修復(fù)過(guò)程［5］。本研究實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ADPKD多囊腎腎組織TBX1 mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)。此外免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，TBX1蛋白在對(duì)照組腎組織腎小管上皮細(xì)胞中呈微量陽(yáng)性表達(dá)，而在多囊腎囊腫組織上皮細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與囊腫發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制相契合。由此推測(cè)TBX1基因可能參與腎小管上皮細(xì)胞的增殖與分化，其過(guò)量表達(dá)可能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度增殖，從而導(dǎo)致囊腫的發(fā)生及增大。TBX1基因表達(dá)異?？赡苁瞧鋮⑴c腎臟囊性病變發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制之一。

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