張如意 張 麗 吳燕川 李 林*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見的老年神經(jīng)退行性疾病之一，以震顫、僵直和運(yùn)動(dòng)不能為主要臨床表現(xiàn)。目前PD的治療主要為多巴胺(dopamine，DA)替代療法，但長(zhǎng)期應(yīng)用后藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)，療效隨時(shí)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱。隨著老齡化社會(huì)的進(jìn)展，PD患者不斷增加，研制新的PD防治藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

二苯乙烯苷(2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG)是傳統(tǒng)中藥何首烏的主要有效成分，具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用［1-2］。前期的研究［3］發(fā)現(xiàn)TSG在體外通過增強(qiáng)線粒體功能、降低氧化應(yīng)激途徑來減少N-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)引起的神經(jīng)元死亡。鑒于線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激在PD發(fā)病中的重要作用，根據(jù)前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究擬采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)制備擬 PD 小鼠模型，觀察TSG對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

TSG由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制，從何首烏中提取，純度70%，實(shí)驗(yàn)中采用干粉劑量，溶于蒸餾水制成藥液，4℃保存。MPTP、辛烷磺酸鈉鹽(octyl sulfate sodium salt，OSA)、多巴胺(dopamine，DA)、二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、二羥基苯甲胺(3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。高氯酸購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。甲醇為天津四面體化工廠色譜純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

小鼠爬桿測(cè)定裝置和小鼠自主活動(dòng)程序儀(CS-2型)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(YLS-4C型)購(gòu)自濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司;高效液相色譜儀為美國(guó)ESA公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)(T21型)為美國(guó)杜邦公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C57BL小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2011-0011。MPTP直接溶于無菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，調(diào)節(jié)其終質(zhì)量濃度為3 mg/mL。小鼠應(yīng)用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組。對(duì)照組:蒸餾水灌胃2周后，腹腔注射與模型組等容積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液5 d;模型組:蒸餾水灌胃2周后，MPTP 30 mg/kg連續(xù)腹腔注射5 d;TSG小劑量組和大劑量組:分別灌胃給予TSG 60 mg/kg和120 mg/kg 2周后，MPTP 30 mg/kg連續(xù)腹腔注射5 d。

1.4 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)

參照秦博文等［4］的方法略作修改:給予MPTP腹腔注射前2 d，先進(jìn)行小鼠爬桿訓(xùn)練，引導(dǎo)動(dòng)物10 s內(nèi)由桿頂爬至桿底，每只每天訓(xùn)練3次。正式測(cè)定時(shí)，記錄給予MPTP腹腔注射1 h后各組小鼠的爬桿時(shí)間，連測(cè)5 d，取均值。具體測(cè)定方法為:持小鼠尾部，將其頭向下置于桿頂部(以小鼠雙后肢置于球上為準(zhǔn))，讓其自然爬下，記錄小鼠自桿頂至雙前肢接觸桿底平臺(tái)所需時(shí)間。

1.5 小鼠自發(fā)活動(dòng)記數(shù)測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)［5］的方法應(yīng)用自主活動(dòng)程序儀測(cè)定小鼠自發(fā)活動(dòng)記數(shù)。當(dāng)計(jì)算機(jī)進(jìn)入測(cè)定程序后，將小鼠放入高13 cm、直徑25 cm活動(dòng)箱中，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄小鼠活動(dòng)情況，測(cè)定每只小鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)。

1.6 小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

參照Liu等［6］的方法略作修改:測(cè)定開始前3 d對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，每日上、下午各1次，訓(xùn)練時(shí)間3 min。正式測(cè)定時(shí)，給予MPTP腹腔注射后70 min測(cè)定小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間，測(cè)定時(shí)間3 min，轉(zhuǎn)速10 r/min，連續(xù)測(cè)定3 d，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7 高效液相色譜法對(duì)腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定

小鼠MPTP腹腔注射5 d后，斷頭處死，取紋狀體，凍于-80℃冰箱。參照Rekha等［7］的方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定。樣品處理:紋狀體組織準(zhǔn)確稱質(zhì)量，按照1∶10的比例加入0.4 mol/L高氯酸，制備組織勻漿，高速冷凍離心機(jī)12 000 g/min，4℃離心15 min。取上清，再次于12 000 g/min，4℃離心15 min。取上清10 μL，應(yīng)用高效液相色譜電化學(xué)法測(cè)定各組大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺。標(biāo)準(zhǔn)品配制:標(biāo)準(zhǔn)品溶于流動(dòng)相中，使用時(shí)稀釋到10 ng/mL，進(jìn)樣量10 μL。色譜條件:安捷倫公司碳十八反相色譜柱，洗脫液:70 mmol/L乙酸鈉，50 mmol/L檸檬酸，100 μmol/L乙二胺四乙酸二鈉，200 μmol/L辛烷磺酸鈉鹽，10%甲醇。調(diào)pH為4.1，過濾脫氣后使用，流量1.0 mL/min。檢測(cè)器工作電壓0.5 V，測(cè)定溫度29℃。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽(yáng)性細(xì)胞

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取3只小鼠進(jìn)行黑質(zhì)處病理切片實(shí)驗(yàn)。小鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定。組織行冠狀面切片，片厚40 μm?？乖迯?fù)后，組織片用3%H2O2室溫孵育10 min，PBS緩沖液充分洗滌。10%羊血清室溫孵育30 min，加入一抗(稀釋度為1∶1 000)，4℃孵育過夜。PBS液充分洗滌。加入生物素標(biāo)記的兔二抗(稀釋度為1∶200)，37℃水浴箱中保溫2 h，PBS液充分洗滌。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗(稀釋度為1∶200)，37℃水浴箱保溫60 min，PBS液充分洗滌。DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照的設(shè)立:以PBS緩沖液代替一抗行免疫組織化學(xué)染色，其余步驟同前。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSG對(duì)MPTP模型小鼠爬桿時(shí)間的影響

爬桿時(shí)間反映小鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力。動(dòng)物協(xié)調(diào)性好，則自桿頂向下爬所需時(shí)間短。如圖1所示，MPTP模型組小鼠爬桿時(shí)間與正常對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，TSG大劑量用藥組小鼠爬桿時(shí)間比模型組縮短(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSG小劑量用藥組小鼠爬桿時(shí)間與對(duì)照組相比延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 TSG對(duì)MPTP模型小鼠爬桿時(shí)間的影響Fig.1 Effect of TSG on pole test in MPTP model mice

2.2 TSG對(duì)MPTP模型小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的影響

以轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPTP模型組小鼠在棒時(shí)間較對(duì)照組顯著縮短(P＜0.01)，TSG大劑量用藥組小鼠與對(duì)照組比，其在棒時(shí)間縮短(P＜0.05)，卻可延長(zhǎng)造模后小鼠的在棒時(shí)間(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見圖2。TSG小劑量用藥不能延長(zhǎng)小鼠在棒時(shí)間。

圖2 TSG對(duì)MPTP模型小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的影響Fig.2 Effect of TSG on Rota rod test in MPTP model mice

2.3 TSG對(duì)MPTP模型小鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響

自主活動(dòng)次數(shù)反映了動(dòng)物的隨意運(yùn)動(dòng)能力。如圖3所示，MPTP模型組小鼠與正常對(duì)照組相比，自主活動(dòng)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TSG高劑量用藥組小鼠自主活動(dòng)雖較對(duì)照組減少(P＜0.01)，但卻較模型組增加(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 TSG對(duì)MPTP模型小鼠自主活動(dòng)的影響Fig.3 Effect of TSG on spontaneous movement in MPTP model mice

2.4 TSG對(duì)MPTP模型小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響

應(yīng)用高效液相色譜電化學(xué)法檢測(cè)小鼠腦紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度。如圖4所示，MPTP模型組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的質(zhì)量濃度較對(duì)照組都降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，TSG大劑量用藥組與對(duì)照組相比，DA和DOPAC的質(zhì)量濃度雖降低，但與模型組小鼠相比則有增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P ＜0.05)。

圖4 TSG對(duì)MPTP模型小鼠腦紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響Fig.4 Effect of TSG on level of dopamine and its metabolites in striatum of MPTP model mice

2.5 TSG對(duì)MPTP模型小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的影響

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的結(jié)果如圖5所示，與正常對(duì)照組相比，MPTP模型組小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TSG大劑量用藥組小鼠黑質(zhì)處TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比下降，但較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

本研究采用的MPTP腹腔注射模型被公認(rèn)是理想的PD動(dòng)物模型之一，已被廣泛用于PD發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)制的研究［8］。本研究中，重復(fù)給予MPTP腹腔注射可以引起小鼠的行為異常，模型小鼠出現(xiàn)尾僵直、豎毛、自主活動(dòng)減少等，其持續(xù)時(shí)間一般約為4～6 h。而TSG用藥組小鼠的癥狀表現(xiàn)較輕，持續(xù)時(shí)間較短。為了客觀評(píng)價(jià)藥物的作用，本研究采用了爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和自主活動(dòng)記數(shù)多種行為學(xué)聯(lián)合的檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，模型組小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降，表現(xiàn)為爬桿時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中的在棒時(shí)間縮短;同時(shí)，模型小鼠出現(xiàn)顯著的自主活動(dòng)減少。TSG用藥組小鼠的行為學(xué)與模型組相比有明顯的改善。

PD的主要病理改變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性死亡，導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量降低，乙酰膽堿系統(tǒng)功能相對(duì)亢進(jìn)，丘腦-皮質(zhì)反饋活動(dòng)和皮質(zhì)發(fā)出的隨意運(yùn)動(dòng)受到過度抑制，導(dǎo)致患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀［9］。多巴胺及其代謝產(chǎn)物減少是PD的主要神經(jīng)生物化學(xué)改變指標(biāo)。中腦黑質(zhì)紋狀體DA的測(cè)定是衡量治療PD是否有效的最客觀指標(biāo)［10］。TH是多巴胺生物合成中的限速酶，被作為多巴胺能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物。因此，本研究應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)了DA及其代謝產(chǎn)物，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)黑質(zhì)處TH陽(yáng)性神經(jīng)元的改變，以期評(píng)價(jià)TSG的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠黑質(zhì)處TH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，紋狀體處DA及其主要的降解產(chǎn)物DOPAC和HVA都有顯著的下降。以上結(jié)果表明，擬PD模型小鼠黑質(zhì)-紋狀體中DA能神經(jīng)元損傷明顯，經(jīng)黑質(zhì)-紋狀體通路投射到紋狀體的DA神經(jīng)遞質(zhì)減少，從而引起紋狀體內(nèi)DA、DOPAC和HVA降低。TSG用藥后，小鼠黑質(zhì)處TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較模型組有明顯的增加，紋狀體中DA和DOPAC都有增加，HVA有一定程度的升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在PD患者殘存的DA神經(jīng)元內(nèi)，主要通過B型單胺氧化酶(monoamine oxidase B，MAO-B)將DA催化降解成 DOPAC。楊秀偉等［11］的研究顯示，何首烏醇提物可能通過抑制MAO-B的活性而影響腦DA降解代謝，從而提高DA及DOPAC的質(zhì)量濃度。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)，TSG可能通過保護(hù)和激發(fā)殘留 DA神經(jīng)元的功能，抑制MAO-B的活性，提高DA神經(jīng)元攝取血中的酪氨酸，保護(hù)和提高TH的活性，促進(jìn)DA生成，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善模型動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性，增強(qiáng)模型小鼠的自主活動(dòng)能力。

圖5 TSG對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞的影響Fig.5 Effect of TSG on counts of TH positive neurons in substantia nigra(SN)of MPTP model mice

氧化應(yīng)激-自由基學(xué)說在PD的發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位［12］。目前，在天然藥物中尋找減少腦部氧化應(yīng)激，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的抗PD藥物成為研究熱點(diǎn)［13］。Li等［14］的研究發(fā)現(xiàn) TSG 具有較強(qiáng)的抗氧化作用。本課題組前期的研究［15］表明TSG能夠增高老年大鼠海馬區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體質(zhì)量濃度，具有神經(jīng)元保護(hù)作用。綜上所述，TSG可能具有防治神經(jīng)退行性疾病如PD的應(yīng)用價(jià)值。

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