曹 曦 謝榮榮 信 中 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730)

特發(fā)性低促性腺激素型性腺功能減退綜合征又名Kallmann 綜合征(Kallmann syndrome，KS)，其特點(diǎn)是性腺功能低下，部分患者合并嗅覺(jué)障礙，先天性瞼中線(xiàn)或肢體畸形，是一種罕見(jiàn)的先天性疾病，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。

該疾病有家族性和散發(fā)性2種類(lèi)型，其中散發(fā)性占60%左右［1］。其遺傳方式可以是X染色體連鎖的隱性遺傳、常染色體顯性和隱性遺傳［2-3］。目前為止，6個(gè)不同的基因已被確定與KS相關(guān):Kallmann syndrome 1(KAL)［4］，fibroblast growth factor receptor 1(FGFR1，也稱(chēng)為 KAL2)［5］，F(xiàn)GF8［6］，prokineticin(PROK2)［7］，prokineticin receptor 2(PROKR2)［8］和 WDR11［9］。

已有的研究［10］顯示KS絕大多數(shù)是X連鎖隱性遺傳。一些KAL1基因異常(錯(cuò)義突變，剪接位點(diǎn)突變，部分基因片段缺失和完整的基因缺失)已經(jīng)在大約10%的散發(fā)性患者和14%～50%的家族性患者中找到。KAL1基因組全長(zhǎng)210 000，含有14個(gè)外顯子，編碼一種680個(gè)氨基酸的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，名叫嗅因子(anosmin-1)。KAL1基因編碼蛋白具有調(diào)控神經(jīng)軸突向外生長(zhǎng)和識(shí)別靶組織或靶細(xì)胞的功能［4］，并且參與促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌神經(jīng)元和嗅覺(jué)神經(jīng)元的遷移［10］。

PROK2是一個(gè)含81個(gè)氨基酸的分泌蛋白，而PROKR2是一個(gè)含384個(gè)氨基酸的G偶聯(lián)受體蛋白。這兩個(gè)基因敲除小鼠模型顯示，它們?cè)谛崆虻男螒B(tài)和性成熟方面發(fā)揮著重要的作用［7］。

本研究利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和直接測(cè)序技術(shù)對(duì)一個(gè) 13歲 KS患者家系進(jìn)行 KAL1、PROK2和PROKR2 3個(gè)基因突變分析，同時(shí)對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者充分了解研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)。通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查獲得每個(gè)家庭成員一般基本情況和詳細(xì)的家族史。同時(shí)對(duì)內(nèi)分泌狀態(tài)、嗅覺(jué)功能和腎功能進(jìn)行了臨床評(píng)估。

采用放射免疫分析法檢測(cè)激素水平，超聲掃描評(píng)估腹部結(jié)構(gòu)，腦部磁共振成像檢測(cè)嗅球、腦溝和內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)。

1.2 基因突變分析

本研究分別利用 SIFT［11］、Polyphen［12］和 Mutation Taster［13］3種生物信息學(xué)平臺(tái)進(jìn)行了錯(cuò)義位點(diǎn)和多態(tài)性位點(diǎn)的功能分析。

1.3 基因突變分析

抽取患者外周血2 mL，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增KAL1、PROK2和PROKR2 3個(gè)基因外顯子區(qū)，引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length

PCR反應(yīng)體系為25 μL，含基因組DNA樣本200 ng、PCR mix 12.5 μL(北京天根生化科技有限公司)、10 μmol/L引物(北京諾賽基因合成)。在 PCR儀(BIO-RED)上完成擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增循環(huán)條件如下:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸5 min，置于4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)目的片段大小。PCR產(chǎn)物直接送北京諾賽基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast軟件比對(duì)分析。每個(gè)突變點(diǎn)經(jīng)過(guò)兩端測(cè)序確認(rèn)，同時(shí)做3次獨(dú)立的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證突變結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢查結(jié)果

患者為13歲的男孩，由于第二性征及外生殖器發(fā)育不良伴視力下降就診。與同齡人相比，患者身高和智力沒(méi)有明顯異常。11歲時(shí)，由于青春期發(fā)育不良進(jìn)行了男性?xún)?nèi)分泌功能評(píng)估，睪丸體積分別為0.65和0.56 mL。氣味測(cè)試揭示嗅覺(jué)減退。腹部超聲掃描顯示，膽囊、胰腺、脾、腎正常。MRI顯示嗅球、嗅束發(fā)育不良(圖1A)。

如表2所示，患者基礎(chǔ)血清雌激素(estradiol，E2)濃度，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，黃體生成素(luteinizing hormone，LH)，睪酮(testosterone，Testo)、皮質(zhì)醇(cortisol，F(xiàn))濃度顯著低于正常參考值。催乳素(prolactin，PRL)和孕酮(progesterone，PROG)濃度正常。

患者的母親有正常的青春期發(fā)育和月經(jīng)周期規(guī)律，血清促性腺激素和雌二醇的濃度正常，同時(shí)MRI結(jié)果顯示嗅球發(fā)育正常(圖1B)。其父親男性化特征明顯，血清促性腺激素和睪酮的濃度正常。

圖1 患者及其母親磁共振結(jié)果Fig.1 MRI findings of the patient and his mother

表2 患者內(nèi)分泌檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Endocrine test results of the patient

2.2 基因突變篩查結(jié)果

如表3所示，患者KAL1基因測(cè)序存在2個(gè)新突變，這2個(gè)突變處于KAL1第12個(gè)外顯子上(I565T和S570T)(圖2B，C)，位于KAL1蛋白的第4個(gè)Ⅲ型纖連素樣(fibronectin typeⅢ domain，F(xiàn)nⅢ)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(圖2A)。此外，測(cè)序還找到了5個(gè)KAL1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn):V534I、V560F、G567S、K666M 和R668H。

值得一提的是，PROKR2基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)核苷酸337位置T突變?yōu)镃，導(dǎo)致113位氨基酸位點(diǎn)由酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸(p.Y113H)(圖2D)。同時(shí)在患者父母基因組中也找到該位點(diǎn)的雜合突變形式(圖2E)。

圖2 KAL1和PROKR2突變位點(diǎn)突變及測(cè)序圖Fig.2 Mutation map and partial nucleotide sequence of KAL1 and PROKR2 gene

2.3 功能缺失分析

3種分析方法都顯示 KAL1的 I565T位點(diǎn)和PROKR2的Y113H位點(diǎn)可能是對(duì)蛋白功能產(chǎn)生危害的突變位點(diǎn)(表3)。

表3 KAL1和PROKR2基因突變分析Tab.3 Summary of molecular analysis of the KAL1 and PROKR2 gene

此外，兩兩分析發(fā)現(xiàn)，Polyphen和Mutation Taster分析顯示G567S和S570T 2個(gè)位點(diǎn)也可能是對(duì)蛋白功能產(chǎn)生危害的突變位點(diǎn)?？紤]到G567S是一個(gè)SNP位點(diǎn)，S570T作為一個(gè)可能的致病位點(diǎn)的可能性比較大。最后總結(jié)3種分析方法和兩兩分析結(jié)果，I565T、S570T和Y113H(PROKR2)3個(gè)位點(diǎn)可能是該患者的致病基因位點(diǎn)。

3 討論

本研究在一個(gè)13歲KS患者KAL1基因中找到2個(gè)新的突變位點(diǎn)(I565T和S570T)和5個(gè)SNP位點(diǎn)(V534I、V560F、G567S、K666M 和 R668H)，同時(shí)在PROKR2基因中找到一個(gè)純合的錯(cuò)義突變位點(diǎn)(Y113H)。這是在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)的第1例KAL1和PROKR2 2個(gè)基因同時(shí)突變的KS患者。

已有的研究［14］顯示KAL1基因突變位點(diǎn)大多數(shù)位于第4個(gè)FnⅢ重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。本研究的2個(gè)新突變位點(diǎn)就位于KAL1蛋白第4個(gè)FnⅢ結(jié)構(gòu)域。FnⅢ結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞黏附分子(CAM)家族成員:纖連蛋白、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)、L1和tenasin有著顯著的同源性［14］。這些分子通常與神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞外和細(xì)胞間的相互黏附、增生和遷移作用相關(guān)，這表明anosmin-1也與這些細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)。此外，已有研究［14］顯示anosmin-1通過(guò)FnⅢ結(jié)構(gòu)域直接與FGFR1蛋白結(jié)合。綜合上述分析，KAL1的I565T和S570T 2個(gè)突變位點(diǎn)很可能是致病位點(diǎn)。

此外，患者KAL1基因中的5個(gè)SNP位點(diǎn)也值得注意。正如在2型糖尿病、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、克雅病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等研究［15-16］中已經(jīng)證實(shí)，多個(gè)SNP位點(diǎn)增加了這些疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。KAL1多個(gè)SNP位點(diǎn)在患者基因組中的同時(shí)存在，也有可能是增加其患病概率的一個(gè)重要因素。

分析PROKR2的蛋白結(jié)構(gòu)，Y113H突變位點(diǎn)位于其第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)。本研究的功能預(yù)測(cè)分析顯示Y113H突變位點(diǎn)很可能為患者的致病位點(diǎn)。而已有研究［17］也證實(shí)，含有Y113H突變位點(diǎn)的PROKR2蛋白，在Egr1-LUC基因轉(zhuǎn)錄分析和基于水母的Ca2+流分析實(shí)驗(yàn)中，其活性嚴(yán)重受損。這表明Y113H突變是PROKR2蛋白一個(gè)重要的功能缺失突變。

KS最初被認(rèn)為是單基因遺傳性疾病，但是后來(lái)陸續(xù)被證實(shí)有多個(gè)基因起作用［18-19］。目前為止，報(bào)道有3例雙基因遺傳的KS患者，1例是FGFR1和NELF基因突變，另2例是KAL1和 PROKR2基因突變［20］，本研究是第4例。KAL1編碼的anosmin-1蛋白被證實(shí)不僅能通過(guò)FGFR1提高了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)［21］，而且能通過(guò) PROKR2在 prokineticin信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用。鑒于上述觀點(diǎn)，本研究假設(shè)KAL1和PROKR2這2個(gè)突變體蛋白可在不同層次進(jìn)行同樣的細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，并且這一過(guò)程可能有助于其漸進(jìn)性功能障礙，最終導(dǎo)致病變［20］。

通常，一些主要的發(fā)育型疾病在純合體狀態(tài)下表現(xiàn)得更加嚴(yán)重。在本研究中，患者癥狀表現(xiàn)為青春期發(fā)育不良和嗅覺(jué)減退/嗅覺(jué)缺失。另一方面，患者父母都攜帶PROKR2基因相同位點(diǎn)的雜合突變，但是沒(méi)有任何臨床癥狀。這一結(jié)果與以前的研究數(shù)據(jù)［22］的一致性，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了之前其他幾項(xiàng)研究［23-25］的結(jié)果，即雙基因突變是一種全新的模式。

本研究存在3點(diǎn)潛在的不足之處，首先，本研究只對(duì)KAL1、PROK2和PROKR2 3個(gè)基因進(jìn)行了測(cè)序，不能排除其他基因的突變情況，比如FGFR1。其次，只對(duì)基因的編碼區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，在其他一些調(diào)控區(qū)，比如啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域，這些區(qū)域都有可能產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)。因此，需要進(jìn)一步研究排除以上的可能性。再次，3個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示I565T(KAL1)和Y113H(PROKR2)可能為致病的突變位點(diǎn)，但是只有2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示S570T(KAL1)為可能的致病位點(diǎn)，筆者考慮到S570T為目前為止首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)突變位點(diǎn)，且Polyphen和Mutation Taster這兩種預(yù)測(cè)方法準(zhǔn)確性都比較高，因此筆者推測(cè)S570T也很可能是一個(gè)致病位點(diǎn)。然而功能缺失分析都只是建立在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，尚需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究擴(kuò)展了KAL1與PROKR2基因在KS患者中突變的多樣性，進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)基因在嗅球發(fā)育中的作用。此外，本研究進(jìn)一步證實(shí)了KS患者雙基因遺傳的可能性，為KS遺傳傳遞的復(fù)雜性提供了新的數(shù)據(jù)。

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