趙志煒 馬麗娜 王 蓉 張 旭 王玉蘭 吳燕川 陳 娟 張景燕

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室北京市老年病醫(yī)療研究中心北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

熱量限制(caloric restriction，CR)是指在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng) 不良的情況下，限制自由攝取的食物量，在1935年最早被發(fā)現(xiàn)［1］。熱量限制已被證實(shí)能夠延長(zhǎng)多種生物的壽命，并且有研究［2］發(fā)現(xiàn)能夠減緩與老化相關(guān)的生理機(jī)能的下降。雖然目前研究發(fā)現(xiàn)很多信號(hào)通路參與到熱量限制的過(guò)程中，但是熱量限制有益效應(yīng)的具體機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期研究［3］中發(fā)現(xiàn)熱量限制能夠改善糖脂代謝，而有研究［4］發(fā)現(xiàn)熱量限制具有神經(jīng)保護(hù)作用，因此，本研究通過(guò)觀察不同熱量飲食對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶和腦內(nèi)胰島素信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探討熱量限制對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶影響的具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57小鼠30只，體質(zhì)量19～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006-009。小鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分成3組:正常對(duì)照組(喂食普通飼料)，高能量組(喂食高能量飼料)，低能量組(喂食低能量飼料)，每組10只，單籠喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑

小鼠Morris水迷宮箱(DMS-2型，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leika公司);脫色搖床(江蘇TS-1型);普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BH-2型)。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

喂養(yǎng)6個(gè)月后，進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。Morris水迷宮系統(tǒng)由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動(dòng)采集和處理分析系統(tǒng)組成。水池直徑100 cm，池高50 cm，池壁標(biāo)有東南西北4個(gè)入水點(diǎn)，將水池等分為4個(gè)象限，分別稱(chēng)SW、NW、SE及NE象限。水深30 cm，于水下2 cm處NW象限中央(最后1 d除外)、距離池壁30 cm的固定部位放置一直徑9 cm、高28 cm的柱形透明有機(jī)玻璃站臺(tái)，池壁黑色，充滿水時(shí)動(dòng)物視覺(jué)無(wú)法辨認(rèn)池內(nèi)有無(wú)站臺(tái)。水池上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，將其輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)軟件分析，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。迷宮外參照物訓(xùn)練期間保持不變。

實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6 d，前2 d訓(xùn)練，后4 d測(cè)試，測(cè)試包括兩部分:1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation):歷時(shí)5 d，第1、2天上、下午各訓(xùn)練1次，入池位置為站臺(tái)所對(duì)象限及所鄰象限，于象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水。120 s未找到站臺(tái)者，由測(cè)試者將其引至站臺(tái)，放置30 s。第3～5天重復(fù)以上操作，若120 s仍不能找到站臺(tái)，則以120 s計(jì)算，不再進(jìn)行引導(dǎo)。從第3天開(kāi)始，記錄找到平臺(tái)所用時(shí)間(即逃避潛伏期)、游泳距離等指標(biāo)。此試驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

2)空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe):定位航行試驗(yàn)結(jié)束后，第6天撤除平臺(tái)，將小鼠從站臺(tái)所對(duì)象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水，記錄小鼠120 s內(nèi)在無(wú)平臺(tái)的水迷宮中第1次穿越平臺(tái)所在位置時(shí)間和在平臺(tái)所在象限游泳距離及穿越平臺(tái)次數(shù)。此實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶。

1.4 固定取材及冰凍切片

喂養(yǎng)6個(gè)月后，每組各取5只小鼠于末次行為學(xué)測(cè)試后灌殺。小鼠用10%(體積分?jǐn)?shù))的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將其仰臥于平臺(tái)上，伸展固定四肢，打開(kāi)胸腔及腹腔充分暴露心臟和肝臟。剪開(kāi)左側(cè)心尖部，經(jīng)左心室插管入主動(dòng)脈并固定，同時(shí)剪開(kāi)右心耳?？焖俟嘧?.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液150 mL左右，快速?zèng)_洗，待血液沖洗干凈至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體后，換用含4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)，先快速再緩慢灌注150 mL左右至小鼠肝臟變硬肢體僵直，即固定完成。然后斷頭，完整取出鼠腦后投入含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中后固定。至腦下沉后，換一次后固定液，即可行冰凍切片。

將固定好的小鼠腦組織修塊，置于少量異戊烷凍存管中，再放入液氮中冷凍10 s左右，迅速放入冰凍切片機(jī)艙內(nèi)，溫度-25℃，包埋鼠腦，片厚20 μm，用于免疫組織化學(xué)染色，每只小鼠于海馬出現(xiàn)后連續(xù)冠狀切片。將切片放入盛有0.01 mol/L PBS溶液的24孔板內(nèi)，浮片法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色(漂片法)

每組選擇6張冰凍切片(厚20 μm)，PBST洗，5min×3次，用3%H2O2室溫孵育10 min;PBST洗，5 min×3次，用與二抗相同來(lái)源動(dòng)物的濃度為5% ～10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的封閉用正常血清(此實(shí)驗(yàn)中為正常山羊血清)封閉非特異性抗原30 min，加入適當(dāng)稀釋的一抗，4℃過(guò)夜;PBST洗，5 min×3次，加入生物素標(biāo)記的適當(dāng)稀釋的二抗室溫孵育2 h;PBST洗，5 min×3次，加入適當(dāng)稀釋的鏈酶菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶三抗，室溫孵育2 h;PBST洗，5 min×3次，DAB顯色，鏡下控制顯色程度，自來(lái)水終止顯色反應(yīng)。撈片;用二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

陰性對(duì)照分別以洗液和非免疫的正常山羊血清代替一抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其余步驟同前。陽(yáng)性反應(yīng)為組織細(xì)胞內(nèi)呈棕黃色染色。

每組小鼠例數(shù)為5只，每只取6張相應(yīng)部位的腦切片，共取30張切片，用顯微鏡觀察海馬部位的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，并于10倍物鏡下計(jì)數(shù)海馬的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 飲食限制對(duì)空間學(xué)習(xí)、記憶的影響

在用Morris水迷宮測(cè)試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力試驗(yàn)中，將小鼠游泳逃避潛伏期和游泳距離作為學(xué)習(xí)記憶的指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比。由表1可以看出，與正常組相比，高能量組和低能量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.979，P=0.389)，但高能量組逃避潛伏期時(shí)間有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，低能量組逃避潛伏期時(shí)間有明顯縮短趨勢(shì)，與高能量組相比，低能量組第3天、第4天、第5天逃避潛伏期都有不同程度的縮短。

表1 Morris水迷宮逃避潛伏期Tab.1 Escape latency of Morris test (s)

由表2可以看出，對(duì)游泳距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與正常組相比，高能量組游泳距離長(zhǎng)，低能量游泳距離短，但各組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.286，P=0.293);與高能量組相比，低能量組第3天游泳距離明顯縮短(P＜0.05)，低能量組第4天、第5天游泳距離與高能量組相比都有不同程度的縮短。

表2 Morris水迷宮游泳距離Tab.2 Swimming distance of Morris (mm)

與正常組相比，高能量組和低能量組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)元SIRT1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB 的表達(dá)

由表3可以看出，與正常組相比，低能量組SIRT1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB 降低(P＜0.01)，高能量組PI3K、Akt/PKB降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

熱量限制是一種有計(jì)劃地減少由食物供給的熱量，一般是在保證足夠的維生素和礦物質(zhì)水平下，將正常自由進(jìn)食的熱量減去30%～50%。研究［2-5］顯示熱量限制可以預(yù)防或減緩年齡相關(guān)的病理變化。熱量限制具有神經(jīng)保護(hù)作用，因此可以延緩對(duì)神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默病的進(jìn)展［6-7］。但熱量限制對(duì)于學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制目前少有研究。

表3 各組動(dòng)物免疫組化結(jié)果Tab.3 Immunohistochemistry of the three groups

本研究采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，研究顯示高能量組逃避潛伏期時(shí)間有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，低能量組逃避潛伏期時(shí)間有明顯縮短趨勢(shì);與高能量組相比，低能量組第3天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。提示熱量限制能夠改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮發(fā)明于20世紀(jì)80年代初，它能比較客觀地衡量動(dòng)物空間記憶，工作記憶及空間辨別能力的改變，是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的重要工具，由于其簡(jiǎn)便易行，檢測(cè)結(jié)果客觀，而廣泛用于空間學(xué)習(xí)記憶功能的研究［8］。因此，本研究采用Morris水迷宮來(lái)評(píng)價(jià)飲食限制對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，高能量組小鼠逃避潛伏期和游泳距離雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但都有所延長(zhǎng)，提示高能量組小鼠存在一定的學(xué)習(xí)記憶障礙。

本研究顯示低能量組小鼠腦內(nèi)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白脫乙酰酶(silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)、磷脂肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt/PKB)、磷酸化應(yīng)答原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，p-CREB)的表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)。胰島素是人體胰島分泌的重要激素，不僅參與能量代謝的調(diào)節(jié)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞還具有營(yíng)養(yǎng)支持和抗凋亡的作用。它能促進(jìn)神經(jīng)元增殖和樹(shù)突芽生，在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)神經(jīng)元，增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力，與中樞的學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)。胰島素作用是通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合激活不同的信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此研究胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)學(xué)習(xí)記憶尤為重要。目前胰島素信號(hào)通路主要有3條:磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)PI3K/AKT通路、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路和磷脂酶 C(phospholipase，PLC)途徑。本研究重點(diǎn)在于觀察PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的變化，觀察的靶蛋白主要包括 SIRT-1、IGF-1、IR、IRS-1、PI3K、Akt/PKB、p-CREB等指標(biāo)。胰島素在體內(nèi)發(fā)揮作用機(jī)制復(fù)雜，胰島素到達(dá)相應(yīng)的靶細(xì)胞以后，與靶細(xì)胞膜表面的胰島素受體(insulin receptor，IR)的α亞基結(jié)合，激活β亞基，導(dǎo)致受體自動(dòng)磷酸化，從而引起胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)的酪氨酸磷酸化，磷酸化的IRS-1可激活PI3K，引起PI3K的活性升高，使 Akt/PKB磷酸化，最終可使CREB磷酸化，促使基因轉(zhuǎn)錄和神經(jīng)元存活以及胰島素的其他功能［9］。但仍有研究［10-11］顯示熱量限制對(duì)認(rèn)知行為沒(méi)有影響或者使其下降，因此，熱量限制對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響存在很多爭(zhēng)議［12-14］，但是不同研究的不同結(jié)果的原因可能由于實(shí)驗(yàn)條件、動(dòng)物種系及測(cè)量學(xué)習(xí)記憶功能方法的不同。本研究對(duì)于熱量限制改善學(xué)習(xí)記憶功能提供了機(jī)制方面的證據(jù)支持，關(guān)于熱量限制與胰島素信號(hào)通路及其他信號(hào)通路更深入的關(guān)系仍待于進(jìn)一步的研究。

總之，熱量限制可以提高C57小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，并且改善腦內(nèi)胰島素信號(hào)通路，由此提示熱量限制可能通過(guò)改善腦內(nèi)胰島素信號(hào)通路從而提高學(xué)習(xí)記憶功能，從而為治療年齡相關(guān)的疾病例如阿爾茨海默病提供可能的治療方案。

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