曹 曦 楊芳遠 史婷婷 謝榮榮 信 中 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensin system，RAS)已被證實參與并促進胰島素抵抗的發(fā)展［1-3］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)-血管緊張素(1-7)〔Ang-(1-7)〕-Ang-(1-7)受體(MAS)軸作為RAS的一個負調(diào)節(jié)軸，可能對2型糖尿病的發(fā)展起到一定的保護作用［3-4］。肝臟是胰島素抵抗發(fā)展過程中的主要器官之一，已經(jīng)證實ACE2在肝臟中表達［5］。本文將在細胞水平進一步研究ACE2/Ang-(1-7)對HepG2細胞糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞資源中心(Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM進行體外培養(yǎng)(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)，接種并置37℃、5%CO2飽和濕度的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d胰酶消化傳代。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

大鼠ACE2基因構(gòu)建到pcDNA3.1/myc-His(-)B(PCDB)(Sino-Geno Max，China)載體上。質(zhì)粒DNA采用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen公司，美國)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明轉(zhuǎn)染HepG2細胞。以pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞作為對照組。細胞轉(zhuǎn)染48 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 RNA的提取和實時定量RT-PCR

應用Trizol法抽提HepG2細胞總RNA(Invitrogen公司，美國)，以2 mg RNA為模板利用Rever TraAceq PCR RT試劑盒(Toyobo公司，日本)反轉(zhuǎn)出cDNA。利用ABI GeneAmp 5700PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)，SYBR Green PCR master mix反應液檢測RNA的表達。經(jīng)分析系統(tǒng)進行相關表達的定量。引物序列如下表:

表1 RT-PCR引物Tab.1 Primers for RT-PCR

1.4 ROS 檢測

HepG2 細胞用 H2O2(250 μmol/L)刺激 5 min，之后用 Ang-(1-7)(10 nmol/L)或 A779(1 μmol/L)處理1 h。二氫乙啶(Dihydroethidium，DHE)檢測:培養(yǎng)的細胞用5 μmol/L DHE(Sigma公司，美國)在37℃黑暗中孵育40 min，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌2次，用胰蛋白酶消化，并懸浮在1 mL PBS，立即用流式細胞儀(Biosciences公司，美國)讀取熒光強度，激發(fā)光為500 nm，發(fā)射光為530 nm。

1.5 Western blotting

在4℃條件下，加入裂解液提取HepG2細胞蛋白。用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白濃度。每個樣本取30～60 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，加入一抗于4℃孵育過夜。TBST漂洗2次，每次5 min，加入1∶5 000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，肌動蛋白(actin)為內(nèi)參，將膜用化學發(fā)光試劑孵育1 min，于X膠片上曝光，常規(guī)顯影、定影。將結(jié)果用Gelpro3.2軟件進行密度分析。P67phox、p22phox購自美國Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計學方法

運用Prism5(GraphPad Software)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較使用t檢驗或方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE2改變糖異生相關基因表達

RT-PCR檢測ACE2過表達細胞中PEPCK和G6Pase mRNA的表達量。結(jié)果顯示，ACE2過表達細胞中PEPCK的表達水平與對照組相比顯著降低(P＜0.01)，而G6Pase與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，詳見圖1。

2.2 ACE2改變HepG2細胞中糖代謝相關基因表達

RT-PCR檢測過表達細胞中 Glut2、IRS-2、AMPKα2和 SOCS-3 mRNA的表達量。結(jié)果顯示，ACE2過表達細胞中Glut2、IRS-2和AMPKα2的表達水平與對照組相比顯著增高(P＜0.01)，而SOCS-3與對照組相比表達量顯著降低，詳見圖2。

圖1 ACE2對HepG2細胞糖異生基因表達的影響Fig.1 The effect of ACE2 on gluconeogenesis genes expression in HepG2 cells

2.3 Ang-(1-7)減低細胞中ROS的產(chǎn)生

用DHE檢測HepG2細胞內(nèi)ROS濃度，用Ang-(1-7)或A779預處理細胞1 h后，用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Ang-(1-7)顯著降低HepG2細胞內(nèi)ROS的濃度，A779顯著增加HepG2細胞內(nèi)ROS的濃度。在H2O2處理下，Ang-(1-7)顯著降低HepG2細胞內(nèi)ROS的濃度，詳見圖3。

圖2 ACE2對HepG2細胞糖代謝相關基因表達的影響Fig.2 The effect of ACE2 on glucose metabolism gene expression in HepG2 cells

圖3 Ang-(1-7)降低HepG2細胞內(nèi)ROS濃度Fig.3 Ang-(1-7)reduces ROS production in HepG2 cells

2.3 激活ACE2/Ang-(1-7)減低NADPH相關亞基表達水平

進一步研究顯示，Ang-(1-7)能顯著降低HepG2細胞內(nèi)NADPH亞基p67和p22的表達。此外，Western blotting檢測結(jié)果也顯示，ACE2過表達，也能顯著降低HepG2細胞中p67和p22的表達，同時，ACE2對氧化應激的保護作用能被A779抑制，詳見圖4。

3 討論

肝臟胰島素抵抗被認為是2型糖尿病的主要原因之一［6］。研究［7-8］表明，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在胰島素抵抗的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。ACE2將AngⅡ分解為Ang-(1-7)，Ang-(1-7)通過其受體MAS抑制AngⅡ信號。MAS缺乏的FVB/N小鼠表現(xiàn)出糖耐量受損，降低胰島素抵抗［9］，提示Ang(1-7)信號在2型糖尿病和代謝綜合征中的作用。ACE2在多種疾病中起到負調(diào)節(jié)RAS的作用［10］。Zucker肥胖糖尿病大鼠的胰島中ACE2蛋白表達升高［11］，高糖誘導下ACE2基因敲除的小鼠胰島素抵抗加?。?2］。這些數(shù)據(jù)提示ACE2在預防胰島素抵抗中的作用。本研究支持了這一觀點，ACE2改善肝臟糖代謝相關基因的表達。

圖4 ACE2/Ang-(1-7)降低HepG2細胞中NADPH相關亞基的表達Fig.4 ACE2/Ang-(1-7)reduce NADPH expression in HepG2 cells

ROS可通過多個過程產(chǎn)生，如線粒體電子傳遞鏈、一氧化氮合酶、黃嘌呤氧化酶，以及NOX家族的NADPH 氧化酶［13］。最近的很多研究［14-16］都在關注NOX酶在胰島素抵抗中的作用。在骨骼肌細胞，血管緊張素Ⅱ誘導的NADPH氧化酶的活化損害胰島素信號［14-15］。ACE2-Ang-(1-7)-MAS 軸，作為 RAS 的一個負調(diào)節(jié)軸，可能通過抗氧化作用以減少胰島素抵抗［16］。本研究結(jié)果支持這一觀點，在HepG2細胞中，ACE2/Ang-(1-7)能通過抑制NADPH氧化酶的表達減低氧化應激作用，對肝臟氧化應激有保護作用。

在本研究中，筆者使用HepG2細胞作為模型細胞研究ACE2/Ang-(1-7)對肝臟胰島素抵抗的影響。眾所周知，AMPK是一個能量傳感器，它調(diào)控糖脂代謝［17］。AMPKα2 的 活 性 與 胰 島 素 抵 抗 相 關［18］。HepG2細胞已被證實通過AMPK調(diào)節(jié)胰島素信號通路和糖代謝相關基因的表達［19］。本研究結(jié)果支持這一觀點，ACE2誘導 AMPKα2的表達，糖異生基因(PEPCE和G6Pase)表達受到抑制，而Glut-2和IRS-2等糖代謝相關基因表達量增加。

SOCS-3屬于SOCS蛋白家族，SOCS-3通過結(jié)合胰島素受體的磷酸化位點來競爭性干預其他含有SH2結(jié)構(gòu)域蛋白的相互結(jié)合［20］。此外，在肝臟中，誘導SOCS-3的表達是白介素-6介導的胰島素抵抗的重要機制之一［21］。綜合上述研究，筆者推測，ACE2/Ang-(1-7)抑制 SOCS-3的表達，進而 SOCS-3抑制IRS-2和AKT磷酸化的能力降低，從而能改善胰島素抵抗。這也可能是ACE2/Ang-(1-7)改善肝臟糖代謝的又一機制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，激活ACE2/Ang-(1-7)可調(diào)節(jié)肝臟糖代謝相關基因的表達，這些基因表達量的改變對肝臟胰島素抵抗有保護作用。而這一過程可能是通過減低氧化應激水平，或是通過AMPKα2和SOCS-3的調(diào)控作用來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果進一步明確了ACE2/Ang-(1-7)在肝臟糖代謝過程中的作用，并為ACE2/Ang-(1-7)在胰島素增敏機制中的作用提供了新的線索。

［1］ Henriksen E J.Improvement of insulin sensitivity by antagonism of the renin-angiotensin system［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293(3):R974-R980.

［2］ Perkins J M，Davis S N.The renin-angiotensin-aldosterone system:a pivotal role in insulin sensitivity and glycemic control［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2008，15(2):147-152.

［3］ Santos S H，Giani J F，Burghi V，et al.Oral administration of angiotensin-(1-7)ameliorates type 2 diabetes in rats［J］.J Mol Med(Berl)，2014，92(3):255-265.

［4］ Santos S H，Braga J F，Mario E G，et al.Improved lipid and glucose metabolism in transgenic rats with increased circulating angiotensin-(1-7)［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(5):953-961.

［5］ Paizis G，Tikellis C，Cooper M E，et al.Chronic liver inju-ry in rats and humans upregulates the novel enzyme angiotensin converting enzyme 2［J］.Gut，2005，54(12):1790-1796.

［6］ Taniguchi C M，Ueki K，Kahn R.Complementary roles of IRS-1 and IRS-2 in the hepatic regulation of metabolism［J］.J Clin Invest，2005，115(3):718-727.

［7］ Richey J M，Ader M，Moore D，et al.AngiotensinⅡ induces insulin resistance independent of changes in interstitial insulin［J］.Am J Physiol，1999，277(5 Pt 1):E920-E926.

［8］ 崔常清.胰島素抵抗的機制與臨床研究進展［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2012，(7):1119-1121.

［9］ Santos S H，F(xiàn)ernandes L R，Mario E G，et al.Mas deficiency in FVB/N mice produces marked changes in lipid and glycemic metabolism［J］.Diabetes，2008，57(2):340-347.

［10］ Clarke N E，Turner A J.Angiotensin-converting enzyme 2:the first decade［J］.Int J Hypertens，2012，2012:307315.

［11］ Tikellis C，Wookey P J，Candido R，et al.Improved islet morphology after blockade of the renin-angiotensin system in the ZDF rat［J］.Diabetes，2004，53(4):989-997.

［12］ Takeda M，Yamamoto K，Takemura Y，et al.Loss of ACE2 exaggerates high-calorie diet-induced insulin resistance by reduction of GLUT4 in mice［J］.Diabetes，2013，62(1):223-233.

［13］ Bedard K，Krause K H.The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases:physiology and pathophysiology［J］.Physiol Rev，2007，87(1):245-313.

［14］Wei Y，Sowers J R，Nistala R，et al.AngiotensinⅡ-induced NADPH oxidase activation impairs insulin signaling in skeletal muscle cells［J］.J Biol Chem，2006，281(46):35137-35146.

［15］臧莎莎，宋桉，宋光耀.骨骼肌胰島素抵抗影響因素研究［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2013，(11):99-101.

［16］ Yuan L，Li X，Li J，et al.Effects of renin-angiotensin system blockade on the islet morphology and function in rats with long-term high-fat diet［J］.Acta Diabetol，2013，50(4):479-488.

［17］ Hardie D G.The AMP-activated protein kinase pathway——new players upstream and downstream［J］.J Cell Sci，2004，117(Pt 23):5479-5487.

［18］ Long Y C，Zierath J R.AMP-activated protein kinase signaling in metabolic regulation［J］.J Clin Invest，2006，116(7):1776-1783.

［19］Nakamaru K，Matsumoto K，Taguchi T，et al.AICAR，an activator of AMP-activated protein kinase，down-regulates the insulin receptor expression in HepG2 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，328(2):449-454.

［20］ Rui L，Yuan M，F(xiàn)rantz D，et al.SOCS-1 and SOCS-3 block insulin signaling by ubiquitin-mediated degradation of IRS1 and IRS2［J］.J Biol Chem，2002，277(44):42394-42398.

［21］ Senn J J，Klover P J，Nowak I A，et al.Suppressor of cytokine signaling-3(SOCS-3)，a potential mediator of interleukin-6-dependent insulin resistance in hepatocytes［J］.J Biol Chem，2003，278(16):13740-13746.