陳予東 楊巍巍 李 昕 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053;2.北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

海馬(hippocampus)，又名海馬回，是哺乳類動(dòng)物腦的邊緣系統(tǒng)的一部分，記憶、學(xué)習(xí)、情感等高級(jí)心理活動(dòng)均與海馬體有關(guān)，該部位的功能損傷和許多精神疾病相關(guān)。近年來(lái)研究［1］發(fā)現(xiàn)，在記憶、學(xué)習(xí)的機(jī)制研究中，神經(jīng)元谷氨酸受體的活化起重要作用，尤其是N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)的激活。NMDARs是電壓依賴性配體門控離子通道，具有對(duì)Ca2+高滲透性，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，以大腦皮質(zhì)和海馬密度最高，參與調(diào)節(jié)胚胎中神經(jīng)系統(tǒng)的形成以及觸發(fā)不同形式的突觸可塑性的分子過(guò)程，包括突觸傳遞的短時(shí)程增強(qiáng)、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)程抑制［2］。NMDARs過(guò)度活躍可觸發(fā)某些機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，NMDARs活動(dòng)異常會(huì)導(dǎo)致一些神經(jīng)認(rèn)知功能的缺失，如阿爾茨海默病、帕金森病等。

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)由 140個(gè)氨基酸組成，在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)豐富表達(dá)，與神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)［4］中發(fā)現(xiàn) α-Syn可以促進(jìn) MES23.5細(xì)胞的NMDARs內(nèi)在化，本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究α-Syn對(duì)海馬神經(jīng)元NMDARs功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

健康Vista大鼠，鼠齡0～12 h，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-2014-004)。重組人 α-Syn，MK-801(Sigma公司，美國(guó))，NMDA(Sigma公司，美國(guó))，Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，B27(Gibco公司，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，胎牛血清(FCS)(Berlin公司，美國(guó))。

電極內(nèi)液(mmol/L):CsCl 70，NaCl 10，HEPES 10，EGTA 10，Na2-ATP，Na2-GTP，CsOH 調(diào)整 pH 至7.3。細(xì)胞外液(mmol/L):NaCl 150，KCl 5，CaCl21.4，葡萄糖 10，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)5，河豚毒素(TTX)0.000 3，木防己苦毒素(picrotoxin)0.1，NBQX 0.01，士的寧(trychnine)0.002，甘氨酸 0.01，NaOH調(diào)整pH至7.3，蔗糖調(diào)整滲透壓至330 mOsm。

玻璃微電極拉制儀(Narishige公司，日本);膜片鉗放大器(Multiclamp 700B)，數(shù)據(jù)采樣板(Digidata 1322A)和數(shù)據(jù)采集分析軟件(pClamp 9.2)(Molecular Devices公司，美國(guó));MiniAnalysis軟件包(Synaptosoft公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 重組人α-Syn的制備

將人α-Syn cDNA插入表達(dá)載體pET。然后將pET-α-Syn轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐西林的2%YTA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，加IPTG誘導(dǎo)基因重組蛋白表達(dá)。所表達(dá)的基因重組型α-Syn采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓?。BCA法定量純化后的α-Syn。

1.2.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

冰上斷頭去除Vista大鼠雙側(cè)海馬，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，用DMEM培養(yǎng)基(90%DMEM+10%胎牛血清)終止消化。巴斯德玻璃滴管火焰拋光后，輕柔吹打。用DMEM培養(yǎng)基稀釋成5×105/mm3的密度接種到直徑35 mm多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。2 h后，顯微鏡下觀察神經(jīng)元貼壁后，改用Neurobasal、B27無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以后每3 d換液1次，培養(yǎng)10～12 d左右用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

α-Syn作用于正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元和用MK-801預(yù)處理過(guò)的海馬神經(jīng)元，觀察NMDA誘發(fā)電流的變化及α-Syn對(duì)NMDA電流的影響。

1.2.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄

采用常規(guī)高阻抗封接的全細(xì)胞記錄模式［5］，記錄細(xì)胞的電信號(hào)輸入膜片鉗放大器(Patch/Whole cell clamp amplifier，CEZ2300，Japan)，而后經(jīng)由模數(shù)轉(zhuǎn)換儀 (Digidata 1320A，Axon Instrument)輸入到計(jì)算機(jī)，經(jīng)10Hz濾波，采樣頻率為2～3 Hz。記錄信號(hào)的監(jiān)測(cè)、存儲(chǔ)及通過(guò)記錄電極給予細(xì)胞的指令電壓以及分析處理由Axon軟件pClamp8.0和Clampfit 8.0完成。全細(xì)胞記錄在22℃ ～24℃室溫下進(jìn)行，維持30 min以上。所有實(shí)驗(yàn)均在鉗制電壓-70 mV進(jìn)行。

1.2.5 給藥方法

通過(guò)軟件控制正壓給藥系統(tǒng)(DAD-12 Superfusion System)的通道給予NMDA(100 μmol/L)。使用HL-2型恒流泵進(jìn)行細(xì)胞外灌流沖洗細(xì)胞，以除去或終止藥物的作用，換藥時(shí)間＜5 ms，給藥時(shí)間為2 s，給藥間隔為28 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

α-Syn抑制海馬神經(jīng)元NMDA誘發(fā)電流。當(dāng)鉗制電壓為-70 mV時(shí)，細(xì)胞外給予100 μmol/L NMDA，在正常培養(yǎng)12 d左右的海馬神經(jīng)元上可誘發(fā)出一較強(qiáng)的內(nèi)向電流［INMDA=-(253.163±49.182)pA，n=12］迅速達(dá)到峰值，給予細(xì)胞外液后電流迅速恢復(fù)至靜息狀態(tài);10 μmol/L α-Syn添加至培養(yǎng)12 d左右的海馬神經(jīng)元，37℃孵育1 h，在鉗制電壓為-70 mV時(shí)，細(xì)胞外給予100 μmol/L NMDA，可觀察到NMDA誘發(fā)電流明顯減?。跧NMDA=-(164.574±45.124)pA，n=12］;NMDA受體非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑MK-801(300 nmol/L)添加至12 d左右的海馬神經(jīng)元，37℃孵育30 min，在鉗制電壓為-70 mV時(shí)，細(xì)胞外給予100 μmol/L NMDA，可觀察到NMDA誘發(fā)電流被完全阻斷，如圖1。α-Syn處理的海馬神經(jīng)元誘發(fā)的NMDA電流與正常海馬神經(jīng)元NMDA電流相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

3 討論

α-Syn和NMDARs的異常均與帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)變性病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［6］。文獻(xiàn)報(bào)道［7］帕金森病發(fā)病機(jī)制包括興奮性氨基酸釋放過(guò)多或滅活機(jī)制受損可引起神經(jīng)興奮性毒性作用。當(dāng)黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元損傷后，谷氨酸能神經(jīng)元異?；钴S，激活NMDARs引起神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載，觸發(fā)相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終致神經(jīng)元變性壞死。

圖1 α-Syn抑制海馬神經(jīng)元INMDA峰值Fig.1 Inhibition of α-Syn on INMDAin cultured hippocampal neurons

圖2 α-Syn對(duì)海馬神經(jīng)元NMDA誘發(fā)電流的作用Fig.2 Effect of α-Syn on INMDAin cultured hippocampal neurons

NMDA誘發(fā)電流的大小反映了神經(jīng)元膜上NMDARs的數(shù)量和功能狀態(tài)［8］，NMDA誘發(fā)電流減小表明α-Syn引起了神經(jīng)元膜上NMDARs活性降低、失活或NMDARs數(shù)量減少。筆者在實(shí)驗(yàn)中觀察到經(jīng)α-Syn抑制了NMDA誘發(fā)電流，進(jìn)一步證實(shí)了α-Syn可引起神經(jīng)元膜的NMDARs數(shù)量減少和功能異常。筆者認(rèn)為α-Syn可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元胞膜NMDARs內(nèi)在化抑制NMDA的神經(jīng)元興奮性毒性，而帕金森患者腦中存在大量異常聚集、修飾的α-Syn，損害α-Syn調(diào)節(jié)NMDARs的內(nèi)在化，從而引起學(xué)習(xí)、記憶障礙，并且這種改變也可能存在于阿爾茨海默病患者腦中。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)α-Syn引起神經(jīng)元膜的NMDARs數(shù)量減少、功能異常，從而抑制了NMDA的神經(jīng)毒性。但因α-Syn相對(duì)分子質(zhì)量小，可自由進(jìn)出胞膜［9］，因此其對(duì)NMDARs的作用是直接作用于膜上的NMDARs還是進(jìn)入胞內(nèi)后通過(guò)其他環(huán)節(jié)再作用于受體，尚需進(jìn)一步探索。

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