張建華 董春霞 任方剛 覃艷紅 楊林花

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科，太原030001)

骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細(xì)胞促進(jìn)骨髓微環(huán)境中破骨細(xì)胞前體(osteoclast precursor cell，pOC)向破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)分化，介導(dǎo)溶骨性骨重吸收，骨質(zhì)溶解及骨重吸收導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)釋放多種細(xì)胞因子促進(jìn)MM細(xì)胞生長(zhǎng)，從而在骨質(zhì)破壞及腫瘤進(jìn)展中形成惡性循環(huán)。研究［1-3］表明，阻斷溶骨途徑可以發(fā)揮抗骨髓瘤效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討正常人破骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的可行性及與MM細(xì)胞之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

8226細(xì)胞引自美國(guó)組織細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑和儀器

RPMI-1640、α-MEM培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料研究所;核因子κB受體激活劑-Fc段(receptor activator of nuclear factor kappa-B Fc，RANKL)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colone-stimulating factor，M-CSF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)為美國(guó)Cytolab公司產(chǎn)品，碘化丙啶、二甲亞砜、耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)為上?；瘜W(xué)試劑三廠產(chǎn)品;Annexin-V凋亡試劑盒購(gòu)自澳大利亞Bender MedSystems公司;地塞米松為上海通用制藥公司產(chǎn)品;Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司;培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司;倒置顯微鏡日本Olympus公司;低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Legaci公司。

1.3 定型的破骨細(xì)胞前體及破骨細(xì)胞的準(zhǔn)備

白細(xì)胞為紅十字中心血站提供，采自健康成年男性。將20 mL白細(xì)胞用無(wú)鈣鎂PBS緩沖液3倍稀釋后，沿管壁緩緩加入盛有Ficoll液的離心管中，使其懸于分離液上方，室溫下2 000 r/min離心30 min后收集混濁帶分離獲得的細(xì)胞，用無(wú)鈣鎂PBS洗3次，后用含10%小牛血清、50 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF 及10 nmol/L 地塞米松的α-MEM培養(yǎng)基(OC培養(yǎng)基)調(diào)整細(xì)胞至2.5×106/mL，接種于25 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2～4 d后用新鮮培養(yǎng)基洗3次去除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為單個(gè)核，TRAP+細(xì)胞，認(rèn)為是定型的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞。繼續(xù)加入OC培養(yǎng)基培養(yǎng)6～10 d后即可形成大量多個(gè)核的破骨細(xì)胞。

1.4 pOC的遷移實(shí)驗(yàn)

趨化實(shí)驗(yàn)采用24孔Transwell培養(yǎng)板，孔徑為5 μm。按millipore transwell操作說(shuō)明進(jìn)行，上室為每300 μL pOC(1×105)懸液(OC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后)，下室為700 μL條件培養(yǎng)基(1×106/mL 8266細(xì)胞培養(yǎng)后)或新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后去transwell insert，TRAP染色，計(jì)算2組細(xì)胞的遷移率。

1.5 pOC的分化實(shí)驗(yàn)

新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或定型的 pOC(1×106/mL)與5×105/mL的8226細(xì)胞在含10%小牛血清、25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基(無(wú)RANKL)共培養(yǎng)7～14 d后行TRAP染色，實(shí)驗(yàn)分為2組:A組為PBMCs+8226細(xì)胞;B組為pOC+8226細(xì)胞。

1.6 PBMC-OC與MM細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

收集上述培養(yǎng)的PBMC-OC，按每孔2.4×104個(gè)接種于24孔板，加入M-CSF及RANKL繼續(xù)培養(yǎng)24 h貼壁。細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)組加入每孔1×105個(gè)8226細(xì)胞，單獨(dú)或共培養(yǎng)3 d、7 d后分別觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)組每孔加入2×105個(gè)8226細(xì)胞，同時(shí)設(shè)非直接接觸組(Transwell組)，單獨(dú)或共培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，采用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)組加入每孔2×105個(gè)8226細(xì)胞，分為2組:去血清培養(yǎng)組用1%α-MEM培養(yǎng)基;地塞米松(Dex)組加入2×10-7μmol/mL Dex，單獨(dú)或共培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，Annexin-V/PI標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.7 OC對(duì)MM細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)

8226細(xì)胞經(jīng)10-6mol/L Dex培養(yǎng)5 d后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，臺(tái)盼藍(lán)(用PBS按1:1稀釋)染色10 min后PBS洗3次，重懸于OC培養(yǎng)基，加至每孔含1×105個(gè)OC的24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)4～24 h后顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC-OC的生長(zhǎng)特性

pOC及成熟的多個(gè)核的OC來(lái)源于健康成人的PBMCs，pOC經(jīng)OC培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后棄去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞大部分為髓系單個(gè)核細(xì)胞，其中95%表達(dá)TRAP，pOC經(jīng)OC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6～10 d后，可見單個(gè)核細(xì)胞逐漸成梭形，融合形成多個(gè)核的TRAP+細(xì)胞。

2.2 MM細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)pOC遷移

采用24孔Transwell培養(yǎng)板行pOC趨化實(shí)驗(yàn)顯示，8226細(xì)胞(1×106/mL)培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)pOC明顯遷移，而新鮮培養(yǎng)基組僅見很少部分細(xì)胞遷移，兩組細(xì)胞的遷移率分別為(28.36±0.08)%、(1.53±0.06)%，(P ＜0.01，圖1)。

圖1 骨髓瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)誘導(dǎo)pOC遷移Fig.1 Multiple myeloma cell conditioned medium induced pOC migration.

2.3 MM細(xì)胞誘導(dǎo)pOC向OC分化

在無(wú)RANKL的培養(yǎng)環(huán)境中，定型的pOC與8226細(xì)胞共培養(yǎng)7～14 d后可見多個(gè)核的TRAP+細(xì)胞形成，而PBMCs與8226細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞逐漸崩解死亡，未見OC生成(圖2A、2B)。

圖2 骨髓瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)pOC遷移Fig.2 Multiple myeloma cells actively attracted pOCs and induced OCs formation(200×)

2.4 PBMC-OC促進(jìn)MM細(xì)胞增生

8266細(xì)胞與PBMC-OC單獨(dú)或共培養(yǎng)3 d、7 d后計(jì)數(shù)顯示，與OC共培養(yǎng)后增生更明顯，細(xì)胞數(shù)分別為:對(duì)照組 (2.1±0.11)×105和(3.9±0.09)×105，共培養(yǎng)組(4.0±0.15)×105和(9.0±0.14)×105(P＜0.01，圖3)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，8226與PBMC-OC直接接觸或非直接接觸培養(yǎng)后，G0/G1期細(xì)胞比例減少，而S期細(xì)胞比例增多。

圖3 PBMC-OC促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增生Fig.3 PBMC-OC stimulate the proliferation of multiple myeloma cells

2.5 MM細(xì)胞促進(jìn)OC存活

在無(wú)M-CSF及RANKL條件下，OC與MM細(xì)胞共培養(yǎng)7 d后，幾乎所有OC仍可存活;相反，OC單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、破碎細(xì)胞增多。

2.6 PBMC-OC可抑制去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的MM細(xì)胞的死亡

8226細(xì)胞用1%α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后Annexin-V-及PI-細(xì)胞(存活細(xì)胞)減少至(26.24±0.11)%，與OC共培養(yǎng)后 Annexin-V-及PI-細(xì)胞為(90.92±0.15)%(P ＜0.01，圖4)。

圖4 PBMC-OC抑制去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞的死亡Fig.4 PBMC-OCs rescued multiple myeloma cells from death in serum-depleted cultures

2.7 PBMC-OC對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MM細(xì)胞的死亡無(wú)拮抗作用

8226細(xì)胞經(jīng)2×10-7μmol/mL Dex培養(yǎng)48 h后41.36%細(xì)胞死亡，與OC共培養(yǎng)后死亡細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯減少，為30.71%(P＞0.05)。

2.8 OC吞噬死亡的MM細(xì)胞

OC可通過(guò)吞噬作用清除死亡的8226細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與存活(圖5)。

圖5 OC吞噬死亡的8226細(xì)胞Fig.5 Osteoclasts phagocytic 8226 cell death(200 × )OC:osteoclasts.

3 討論

MM骨病以MM細(xì)胞浸潤(rùn)部位成骨細(xì)胞減少為特征，提示腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)產(chǎn)生關(guān)鍵的OC生成因子直接增強(qiáng)OC活性。臨床實(shí)驗(yàn)及MM動(dòng)物模型研究顯示［1-3］，OC 抑制劑，包括雙磷酸鹽、RANK-Fc及骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin，OPG)，不僅阻斷MM介導(dǎo)的骨質(zhì)破壞，而且發(fā)揮抗骨髓瘤效應(yīng)阻止腫瘤進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)提示OC與MM細(xì)胞之間的相互作用可能對(duì)骨髓瘤細(xì)胞在骨髓中擴(kuò)增發(fā)揮重要作用。然而由于OC體外分離培養(yǎng)的困難，這一作用以及相關(guān)機(jī)制的研究涉及甚少。

本實(shí)驗(yàn)參照 Sabokbar等［4］及 Yaccoby 等［5］的體外OC培養(yǎng)方法，利用采自健康成年男性的白細(xì)胞分離出單個(gè)核細(xì)胞，在完全OC培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后可見大部分髓系單個(gè)核細(xì)胞為TRAP+細(xì)胞，即定型的pOC。pOC與8226細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在無(wú)基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，MM細(xì)胞可招募定型的pOC，直接促進(jìn)其向成熟的OC分化，而MM細(xì)胞并不促進(jìn)未定型的祖細(xì)胞向OC分化，提示定型的pOC可能上調(diào)MM細(xì)胞對(duì)RANKL的表達(dá)，在骨髓微環(huán)境中其他細(xì)胞或細(xì)胞因子把髓系單個(gè)核祖細(xì)胞定型為破骨細(xì)胞系。這與Yaccoby等［5］利用原代 MM漿細(xì)胞與采自 MM患者外周血分離培養(yǎng)的OC共培養(yǎng)結(jié)果一致，他們推測(cè)MM患者骨中除成骨細(xì)胞減少外，血管內(nèi)皮細(xì)胞增多可能也參與上述過(guò)程。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以產(chǎn)生趨化因子對(duì)單個(gè)核細(xì)胞具有趨化作用，表達(dá)OC生成的關(guān)鍵因子如M-CSF、RANKL及OPG，還可以直接誘導(dǎo)活化的多個(gè)核OC生成。Okada等［6］研究證實(shí)，B9/BM1鼠MM細(xì)胞通過(guò)CD44上調(diào)骨髓內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RANKL，進(jìn)而通過(guò)直接接觸作用促進(jìn)pOC向OC分化并遷移至骨髓。

在上述培養(yǎng)體系中，pOC經(jīng)完全OC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6～10 d后，可見單個(gè)核細(xì)胞逐漸成梭形、融合形成多個(gè)核的TRAP+細(xì)胞，即為破骨細(xì)胞。隨后本課題組將OC與MM細(xì)胞(8226細(xì)胞)共培養(yǎng)后行顯微鏡觀察計(jì)數(shù)、PI染色檢測(cè)細(xì)胞增生周期及Annexin-V/PI標(biāo)記檢測(cè)存活細(xì)胞比例顯示，在無(wú) M-CSF及RANKL條件下，MM細(xì)胞仍可促進(jìn)OC存活;OC明顯非IL-6細(xì)胞系增生，抑制去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的MM細(xì)胞死亡，直接或間接共培養(yǎng)組OC均可促進(jìn)MM細(xì)胞進(jìn)入S期，提示MM細(xì)胞與OC之間的相互作用是雙向的。這與Abe等［7］研究結(jié)果一致，健康人群及MM患者自身PBMC-OC均可促進(jìn)MM細(xì)胞存活，且作用強(qiáng)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞。他們的研究結(jié)果還顯示，OC可以拮抗阿霉素誘導(dǎo)的MM細(xì)胞的死亡，OC與MM細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-6及骨橋蛋白(osteopontin，OPN)分泌增多，阻斷細(xì)胞之間的相互作用后IL-6質(zhì)量濃度明顯下降，但MM細(xì)胞增生與IL-6質(zhì)量濃度增加并無(wú)明顯相關(guān)。本課題組研究結(jié)果顯示，OC對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MM細(xì)胞死亡并無(wú)拮抗作用。結(jié)合Abe等［7］研究結(jié)果提示MM骨病患者可能對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥，而地塞米松對(duì)MM骨病患者的MM細(xì)胞仍具有殺傷作用。本課題組將8226細(xì)胞誘導(dǎo)死亡與OC共培養(yǎng)24 h后通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，OC可以吞噬死亡的MM細(xì)胞，Yaccoby等［5］研究結(jié)果也顯示OC可通過(guò)吞噬作用清除凋亡及死亡的MM細(xì)胞，而不影響MM細(xì)胞的活力及生長(zhǎng)存活的能力。上述結(jié)果提示OC可能通過(guò)直接接觸作用或與某些細(xì)胞因子的分泌共同作用，以及對(duì)MM細(xì)胞的吞噬作用促進(jìn)MM細(xì)胞增生與存活。

Zavrski等［8］體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑(MG-132、MG-262)通過(guò)抑制破骨細(xì)胞中蛋白酶體-泛素系統(tǒng)阻斷RANKL介導(dǎo)的OC生成及其生物學(xué)活性。在以硼替佐米為主方案治療合并骨病的MM患者臨床研究中也顯示［9-11］，除優(yōu)越的疾病緩解率外，骨痛緩解率及骨質(zhì)修復(fù)亦明顯高于其他方案，其中不乏更多的節(jié)點(diǎn)因子參與。本課題組已經(jīng)完成的破骨細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用這一研究結(jié)果也顯示［12］，RANKL/OPG在二者相互作用中發(fā)揮重要作用。為體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的可行性及簡(jiǎn)便性進(jìn)一步研究其與骨髓瘤細(xì)胞相互作用中的節(jié)點(diǎn)因子提供了可靠的平臺(tái)，RANKL/OPG在這一相互作用中的重要性及其對(duì)MM分期及骨病早期評(píng)價(jià)中的地位有待進(jìn)一步研究證實(shí)［13］。

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