劉夫紅 陳振萍 馬靜瑤 魏沄沄 吳潤暉

(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心，北京100045)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種最常見的獲得性免疫介導的、以血小板數(shù)目下降和皮膚黏膜出血為主要臨床表現(xiàn)的出血性疾?。?］。迄今為止，認為ITP的主要發(fā)病機制尚不明確，但是免疫失耐受被認為是出現(xiàn)自身免疫異常的核心環(huán)節(jié)。近年來對ITP免疫失耐受的機制進行了很多的研究，其中調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+/CD25+regulatory T cells，Treg)的研究尤為引人注目。

調(diào)節(jié)性T細胞可產(chǎn)生抑制性細胞因子［如白介-10(interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等］依賴細胞毒 T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)等共刺激分子，通過細胞-細胞接觸依賴的抑制模式發(fā)揮作用，最終通過抑制Th細胞的活化/分化及直接抑制B細胞活化產(chǎn)生抗體兩種途徑來阻止自身免疫病的發(fā)生［2］。FOXP3(Forkhead Box P3)基因特異性表達于 Treg細胞，調(diào)節(jié)Treg細胞的抑制功能，從而在免疫性疾病的發(fā)病中起到重要作用［3-4］。研究［5］表明在慢性 ITP患兒中存在Th17/Treg平衡紊亂。ITP患兒中CD4+CD25+T細胞明顯減低，并且FOXP3呈低表達狀態(tài)［6-7］。提示FOXP3基因表達差異及Treg細胞數(shù)量在ITP的發(fā)病中起重要作用。而FOXP3基因表達的差異被認為與基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)有關，并且目前研究［8-9］表明FOXP3基因單核苷酸多態(tài)性與多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematos，SLE)、類風濕性關節(jié)炎等相關。ITP作為一種比較經(jīng)典的自身免疫性疾病，Treg細胞及FOXP3在其發(fā)生及發(fā)展中起到了重要作用，推測FOXP3基因多態(tài)性與ITP遺傳易感及疾病進展相關性有關，但尚未見報道。結合 HapMap網(wǎng)站［10］中漢族人群資料，由于在中國人群中 FOXP3基因啟動子區(qū)及外顯子區(qū)的SNP位點均無頻率，故本研究選取了第1內(nèi)含子區(qū)內(nèi)變異頻率相對較高且研究較為廣泛的3個SNP位點:rs2232365、rs3761547和rs3761548進行基因測序研究。

1 材料與方法

1.1 病例來源

本研究從2009年10月至2013年12月收集首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心病房確診的兒童ITP患者病例標本及病例資料作為研究組;同期收集與實驗組患兒臨床資料相匹配的健康志愿者的血液標本作為對照組。所有入組患兒鑒護人均簽署知情同意書。

1.2 疾病定義及分組標準

ITP的診斷標準與既往研究［1］報道相同。

由于實驗組與健康對照組年齡存在差異，為避免年齡差異所導致的偏倚，故在與對照組進行比較時，對實驗組年齡匹配，具體原則為:在統(tǒng)計專家指導下，實驗組患兒從最小年齡開始逐一剔除，保證2組年齡差異無統(tǒng)計學意義的同時保證最大樣本量，匹配后實驗組病例共135例，其中男81例，女54例。中位年齡:94月，兩組在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.838和0.098)。

實驗組根據(jù)病程及轉歸又分為2組，觀察時間不足12個月且尚未緩解者及失訪患兒不計入上述2組:

(1)病程在12個月以內(nèi)組:ITP患兒在12個月內(nèi)獲得完全緩解，血小板計數(shù)＞100×109/L;

(2)病程在12個月以上組:ITP患兒在12個月內(nèi)尚未獲得完全緩解，血小板計數(shù)仍＜100×109/L。

1.3 DNA 提取

紫帽管(含EDTA抗凝劑)收集，并保證在采集后2 h內(nèi)提取全血細胞。利用DNA提取試劑盒DNeasy Blood＆Tissue Kit(QIAGEN)提取全血細胞DNA。

1.4 基因型測定

采用Sequenom SNP位點分型檢測方法進行基因多態(tài)性位點檢測。

10%樣本進行重復測定并同時利用直接測序的方法進行比對，其一致率100%，再次確認實驗過程及結果的準確性和可信性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例數(shù)及百分比表示，組間比較采用Person χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的臨床特征

入選該實驗并進行SNP統(tǒng)計學計算的樣本包括實驗組病例328例，其中男194例，女134例;中位年齡:36個月，范圍1～210個月;對照組219例，其中男129例，女90例;中位年齡:84個月，范圍36～156個月。實驗組根據(jù)臨床隨訪1年轉歸分為:1)病程在12個月以內(nèi)組:197例;2)病程在12個月以上組:68例;3)觀察時間不足12個月尚未緩解者:40例;4)失訪:23例。具體詳見表1。

2.2 基因型及基因頻率在各組之間的比較

對照組FOXP3基因3個SNP位點與基因頻率與HapMap中統(tǒng)計的中國北京漢族健康人群的基因頻率相一致，差異無統(tǒng)計學意義。具體詳見表2。提示對照組的代表性及實驗的可靠性。

表1 一般病例資料Tab.1 The characteristics of the subjects

表2 FOXP3 3個位點在對照組及HapMap中中國北京漢族健康人群基因頻率比較Tab.2 FOXP3 SNP alleles in controls and CHB

SNP位點等位基因和基因型頻率分布及其在性別年齡均匹配實驗組與對照組之間的比較:rs2232365位點基因型在性別年齡均匹配實驗組及對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035)，且性別年齡均匹配實驗組AG基因型頻率較正常對照組明顯增高(P=0.013，OR值2.093，95%可信區(qū)間范圍1.156～3.793)。rs3761547位點基因型及頻率在性別年齡均匹配實驗組及對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.738和0.787)。rs3761548位點基因型及頻率在性別年齡均匹配實驗組及對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.711和0.811)。詳見表3。

表3 FOXP3 SNP各位點基因型和等位基因的頻率在性別年齡均匹配實驗組及對照組之間的比較Tab.3 FOXP3 SNP genotypes/alleles in age-and sex-matched patients and controls n(%)

SNP位點等位基因和基因型頻率在不同病程間的比較:rs3761547位點基因型在不同病程間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)，且12個月以上組GG基因型較 12月以內(nèi)組明顯增高，(P=0.008，OR值2.579，95%可信區(qū)間范圍1.255至5.299)提示攜帶GG型基因患者可能預后欠佳，病程遷延，且該位點A與G基因頻率在兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，提示該位點單核苷酸多態(tài)性與兒童ITP病程及疾病進展有相關性，攜帶G型基因更易發(fā)展為慢性，病程遷延。

rs3761548位點基因型及頻率在不同病程間差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.839和0.506)，提示該位點單核苷酸多態(tài)性與 ITP病程進展無相關性。rs2232365位點基因型在不同病程間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.232)，但該位點A與G基因頻率在2組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)，提示該位點基因頻率單核苷酸多態(tài)性與ITP病程進展有相關性，攜帶G型基因更易發(fā)展為慢性，病程遷延詳見表4。

表4 FOXP3 SNP位點各基因型和等位基因的頻率及其在不同病程中的比較Tab.4 FOXP3 SNP genotypes/alleles in different disease course groups n(%)

3 討論

自身免疫性疾病是一類復雜的，多有遺傳背景的疾病，其發(fā)生及發(fā)展可能是遺傳因素及環(huán)境因素相互作用的結果［11-12］。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)研究有助于解釋個體的表型差異，其多態(tài)性研究可能會進一步揭示基因不同表達導致其參與免疫調(diào)控差異的多樣性機制。人類FOXP3基因突變和單核苷酸多態(tài)性被證實可以導致多種自身免疫性疾病的產(chǎn)生。目前已經(jīng)被證實FOXP3基因單基因突變(AAUAAA→AAUGAA)可以導致人類免疫失調(diào)、多發(fā)性內(nèi)分泌腺病、腸病、X連鎖綜合(即IPEX 綜合征)［13］。Ban 等［14］研究表明 FOXP3 基因多個位點基因多態(tài)性與高加索及日本地區(qū)自身免疫性甲狀腺疾病密切相關。國內(nèi)Chen等［15］研究證實FOXP3基因rs2280883和rs3761549多態(tài)性可能與B型乙型肝炎病毒相關性原發(fā)性肝癌有相關性;Lan等［16］研究表明FOXP3基因rs3761549基因多態(tài)性與SLE相關，且T等位基因為壯族自治區(qū)SLE的危險因素，Zhang等［17］證實 FOXP3 IVS9+459基因與重癥肌無力有相關性。從而提示FOXP3基因多態(tài)性在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的重要作用。而在與本文相關的3個位點研究中:

3.1 在FOXP3 rs3761547位點研究中

Song［18］發(fā)現(xiàn)該位點基因多態(tài)性與銀屑病的發(fā)病相關，攜帶AA+AG基因型者更有遺傳易感性;此外國內(nèi)研究［19］表明該位點與過敏性鼻炎的發(fā)病相關性不大，但是與塵螨過敏患者發(fā)展為過敏性鼻炎相關［20］。本研究結果表明該位點基因多態(tài)性在不同ITP病程間差異有統(tǒng)計學意義，且病程在12個月以上組GG基因型較病程12月以內(nèi)組明顯增高，提示該位點單核苷酸多態(tài)性與兒童ITP病程及疾病進展有相關性，攜帶GG型基因患者及G型基因患者更易發(fā)展為慢性，病程遷延，預后不佳。但與兒童ITP的遺傳易感性無相關性。

3.2 在FOXP3 rs3761548位點研究中

研究［21］表明rs3761548 AA基因型攜帶者腎移植后獲得免疫排斥反應的概率是rs3761548 CC型攜帶者的4倍，rs3761548基因多態(tài)性與腎移植后免疫排斥反應有顯著相關性;攜帶rs3761548A型等位基因可以增加不明原因流產(chǎn)的風險［22］。rs3761548 AA型在漢族及匈牙利民族變應性鼻炎中均為保護因素，在女性狼瘡患者中有更低的ds-DNA表達，但卻有更高的白癜風及牛皮癬患病可能［18，23-25］。但也有學者研究［26-29］表明rs3761548與銀屑病、多發(fā)性硬化、先兆子癇、子宮內(nèi)膜異位、重癥肌無力等疾病的發(fā)病無相關性。本實驗結果顯示該位點基因多態(tài)性在性別年齡均匹配實驗組及對照組之間差異無統(tǒng)計學意義，在不同病程之間的比較中差異也無統(tǒng)計學意義，提示該位點與兒童ITP的發(fā)病及疾病進展尚無明顯的相關性。

3.3 在FOXP3 rs2232365位點研究中

Wu等［22］研究表明rs2232365G型可以增加不明原因流產(chǎn)的風險;rs2232365AA型患者有更高的銀屑病遺傳易感性［13］，但也有研究［24］證實該位點基因多態(tài)性與漢族人群銀屑病遺傳易感性尚無明顯相關性。本實驗結果顯示rs2232365位點AG基因型頻率在性別年齡均匹配實驗組較正常對照組明顯增高，提示位點基因型多態(tài)性與兒童ITP發(fā)病相關，攜帶AG基因型可能為兒童ITP發(fā)病的易感因素，且在實驗組不同病程之間比較時差異有統(tǒng)計學意義，攜帶G型基因更易發(fā)展為慢性，病程遷延。

本研究結果提示FOXP3基因作為Treg細胞重要的調(diào)節(jié)因子，其單核苷酸多態(tài)性可能與兒童ITP的疾病發(fā)生及病程進展相關，有助于兒童ITP的診斷及預后判斷。外源性引入FOXP3+Treg細胞有效阻止了異基因移植排斥反應［30］，在移植中起到重要作用［31］。提示FOXP3基因可作為免疫性疾病靶向治療的關鍵。而本實驗中rs2232365位點基因多態(tài)性提示與ITP的發(fā)生發(fā)展均有相關性，有可能是疾病機制的關鍵，更有可能為疾病的治療靶點提供證據(jù)。

結論:rs2232365位點基因型單核苷酸多態(tài)性與ITP發(fā)病相關，攜帶AG基因型可能為ITP發(fā)病的易感因素，rs3761547 GG基因型及 G等位基因、rs2232365位點G等位基因的ITP患兒更易發(fā)展為慢性，病程遷延。rs3761548位點單核苷酸多態(tài)性表達與兒童 ITP疾病進展及轉歸無相關性。FOXP3 rs2232365位點單核苷酸多態(tài)性與兒童ITP的發(fā)生發(fā)展均相關，可能是疾病機制的關鍵，更有可能為疾病的治療靶點提供證據(jù)。

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