熊 磊，年四輝，朱 玉

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.生化教研室;2藥學(xué)院;3.公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

滁菊是菊科植物菊(Dendranthema morifolium)的干燥頭狀花序，分布在安徽省滁州地區(qū)，為我國(guó)四大藥菊之首，藥用、茶用價(jià)值較大，是我國(guó)傳統(tǒng)的保健食品。滁菊中除含有揮發(fā)油［1］、黃酮類［2］等藥效成分外，尚含有多糖、膽堿、氨基酸等多種成分［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，多糖除具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗腫瘤作用外［4］，尚具有抗氧化作用［5］。滁菊常采用乙醇提取黃酮類成分，而提取后的藥渣作為廢物丟棄，易造成資源浪費(fèi)，環(huán)境污染。為綜合利用滁菊藥用資源，本課題擬對(duì)滁菊多糖的提取作進(jìn)一步的研究。

菊花多糖提取傳統(tǒng)工藝一般采用水提醇沉法，操作簡(jiǎn)單易行，但多糖得率較低［6］，亦有應(yīng)用果膠酶提取滁菊多糖的文獻(xiàn)報(bào)道［7］。纖維素是由D-葡萄糖-1，4糖苷鍵連接而成，是植物細(xì)胞壁主要組成成分，纖維素酶能特異性降解纖維素，從而破壞植物細(xì)胞壁而促進(jìn)藥效成分溶出［8］，因此纖維素酶法近年逐漸應(yīng)用于中藥有效成分提取研究中。本研究以纖維素酶法從滁菊藥渣中提取滁菊多糖，并進(jìn)一步研究滁菊多糖抗氧化性，以期為滁菊藥用資源的綜合利用開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

滁菊取自安徽菊泰滁菊草本科技有限公司;纖維素酶(Yakult Honsha Co.，Ltd.，35 000 U/g);葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、石油醚、抗壞血酸、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)等以上試劑均為分析純;UV-9100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司;R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;DZKW-D恒溫水浴鍋等。

2 方法

2.1 滁菊藥渣干品的制備、纖維素酶和乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配制 滁菊洗凈烘干后經(jīng)80%乙醇浸提兩次，每次各2 h，將滁菊藥渣揮干乙醇，用粉粹機(jī)粉碎后備用。將纖維素酶配制成700 U/ml酶制劑，4℃保存，用前搖勻。配制pH范圍在4～6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液備用，稱取無(wú)水乙酸鈉，加冰乙酸，加水稀釋，并用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH值。

2.2 酶法提取滁菊多糖工藝流程 稱取滁菊藥渣粗粉2.0 g，添加緩沖溶液50 ml和纖維素酶液;恒溫水浴控制酶解時(shí)間;加入250 ml蒸餾水于100℃水浴浸提2.5 h;抽濾，將提取液濃縮至20 ml;加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)10 ml脫蛋白，重復(fù)操作;加入95%乙醇醇沉24 h;沉淀分別用乙醇、丙酮、石油醚洗滌2～3次;真空干燥得滁菊多糖粗品。

2.3 纖維素酶酶解條件 保持其他因素條件不變，以酶解 pH值 4.5、酶解溫度 55℃、酶解時(shí)間100 min和酶用量20 U/g為基礎(chǔ)條件，分別考察纖維素酶的酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量4個(gè)單因素對(duì)滁菊多糖得率的影響，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交因素水平見(jiàn)表1。

表1 纖維素酶解正交因素水平Tab 1 Factors affecting the celluslase degradation by orthogonal test

2.4 滁菊多糖得率的計(jì)算 精密稱取葡萄糖對(duì)照品100 mg，制備成0.1 mg/ml的對(duì)照品溶液，分別稀釋成 10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，120.0，140.0 μg/ml的8 個(gè)濃度對(duì)照品溶液，按苯酚-硫酸法［7］在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程:

將滁菊多糖粗品溶解，按苯酚-硫酸法，依據(jù)已制定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出滁菊多糖含量，按下列公式計(jì)算滁菊多糖得率:

2.5 滁菊多糖的抗氧化性(清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基)滁菊多糖配制 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/ml 5 個(gè)濃度和抗壞血酸溶液 0.2 mg/ml備用，分別取上述溶液2 ml與0.2 mmol/L的DPPH溶液2 ml混勻，放置30 min，測(cè)定吸光度(Ai)(波長(zhǎng)517 nm)。上述溶液各2 ml分別與2 ml無(wú)水乙醇混合，測(cè)定同波長(zhǎng)處的吸光度(Aj)。以DPPH溶液與無(wú)水乙醇反應(yīng)作為對(duì)照，測(cè)定吸光度(A0)。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為:

取0.05 mol/L 的 Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)4.5 ml，25℃水浴中預(yù)熱20 min后，分別取上述備用溶液各1 ml和0.4 ml 25 mmol/L鄰苯三酚溶液混勻，25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L的HCl溶液1 ml終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)定吸光值(Ai)。對(duì)照組以蒸餾水代替多糖溶液，在同波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(A0)超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式為:

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨著溶液pH值增大，滁菊多糖得率先升高后降低，在pH為5.0達(dá)到最大值。過(guò)高或過(guò)低的pH值會(huì)影響酶蛋白構(gòu)象，影響酶的活力，pH值還會(huì)影響底物分子解離，影響反應(yīng)速度。因此最佳酶解pH為5.0(圖1)。隨著酶解溫度的升高，滁菊多糖得率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度升高時(shí)，纖維素酶活性增加，反應(yīng)速度增大，但超過(guò)最適溫度后，溫度升高酶蛋白開(kāi)始變性，酶的活性受到破壞，從而影響多糖得率。因此溫度升高可以增加纖維素酶的活性，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活，圖2看出，酶解溫度55℃，滁菊多糖得率最大(圖2)。酶解時(shí)間對(duì)滁菊多糖得率提高有影響，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶解程度越高，從而促進(jìn)多糖的溶出，但隨時(shí)間增長(zhǎng)，酶解作用趨于飽和，多糖得率增幅明顯減緩，最佳酶解時(shí)間為120 min(圖3)。隨著酶用量增加，滁菊多糖得率出現(xiàn)先升高后保持不變的趨勢(shì)，因此酶用量會(huì)直接影響多糖得率。隨著酶用量的增加，細(xì)胞壁中的纖維素水解速度提高，致使多糖更快地溶出;達(dá)到最大值后，隨酶用量的增加，底物被酶分子飽和，纖維素被水解的速度趨于穩(wěn)定，多糖得率也趨于穩(wěn)定。因此最佳酶用量定為25 U/g(圖4)。

圖1 酶解pH對(duì)滁菊多糖得率的影響Fig 1 pH value on the recovery rate of polysaccharide

圖2 酶解溫度對(duì)滁菊多糖得率的影響Fig 2 Temperature at enzymolysis on the recovery rate of polysaccharide

圖3 酶解時(shí)間對(duì)滁菊多糖得率的影響Fig 3 The extraction time on the recovery rate of polysaccharide

圖4 酶用量對(duì)滁菊多糖得率的影響Fig 4 Enzyme dosage on the recovery rate of polysaccharide

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)極差分析結(jié)果，由表2得到4個(gè)因素對(duì)滁菊多糖得率影響的主次順序依次是B＞A＞D＞C。對(duì)4個(gè)因素進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)因素C引起的變異最小。表3方差分析結(jié)果表明，因素B的P值＜0.05，即酶解溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，較好的工藝組合為A3B3C1D1。所以最佳酶提取條件為:酶解pH 5.5、溫度60℃、酶用量20 U/g、酶解時(shí)間100 min。

表2 纖維素酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Orthogonal test results in cellulase degradation

表3 纖維素酶解方差分析Tab 3 Variance analysis for cellulase degradation

3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 稱取滁菊藥渣粗粉2.0 g 3份，按2.3方法在酶解 pH 5.5、溫度 60℃、酶用量20 U/g、酶解時(shí)間100 min的條件下提取滁菊多糖，按2.4公式計(jì)算出滁菊多糖平均得率為13.89%，多糖得率高于正交試驗(yàn)組;另稱取滁菊藥渣粗粉2.0 g 3份，不經(jīng)酶解直接提取，滁菊多糖平均得率為5.32%。因此，經(jīng)過(guò)纖維素酶解處理，可以顯著提高多糖得率。

3.4 滁菊多糖對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除作用 表4可以看出，滁菊多糖濃度范圍在0.2～1.0 mg/ml對(duì) DPPH自由基的清除率在47.25% ～89.92%，隨著濃度增加，清除率迅速增大。滁菊多糖在高濃度下(1.0 mg/ml)清除率已經(jīng)超過(guò)0.2 mg/ml的抗壞血酸溶液，具有較好的抗氧化作用。同濃度的滁菊多糖對(duì)DPPH自由基清除率比對(duì)超氧陰離子自由基更高。

滁菊多糖濃度范圍在0.2～1.0 mg/ml對(duì)超氧陰離子的清除率為 8.66% ～48.26%，濃度為1.0 mg/ml的滁菊多糖清除率超過(guò) 0.2 mg/ml的抗壞血酸。表明滁菊多糖對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，說(shuō)明滁菊多糖在高濃度下抗氧化活性較好。

表4 滁菊多糖對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率Tab 4 Scavenging rates of DMP on DPPH free radical and superoxide anion free radical

4 討論

本研究中通過(guò)纖維素酶解滁菊藥渣得到的多糖得率低于劉漢珍等［7］通過(guò)果膠酶酶解滁菊得到的多糖得率。果膠是一種酸性多糖，果膠的存在不同程度影響或阻礙中性多糖的釋放［9］。果膠酶通過(guò)促進(jìn)中性多糖溶出，提高了多糖得率，但同時(shí)由于增大了中性多糖在粗多糖中的比例，改變了原有粗多糖的組成。而纖維素酶是通過(guò)降解細(xì)胞壁纖維素從而促進(jìn)多糖成分的溶出［10］，顯著高于熱水浸提法。纖維素酶破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物更易溶出，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)纖維多糖溶出，增大了多糖得率，此法溫和高效，保證藥效成分的穩(wěn)定。比較兩者提取工藝:果膠酶法提取的最佳條件(也是酶處理的最佳條件)為酶解溫度50℃、酶解時(shí)間1.5 h、酶用量52.96 U/g;本文纖維素酶法提取最佳條件為酶解pH 5.5、溫度 60 ℃、酶用量 20 U/g、酶解時(shí)間100 min，雖然酶解溫度略高，但酶用量和酶解時(shí)間均小于果膠酶，較為經(jīng)濟(jì)。酶法提取工藝應(yīng)用越來(lái)越廣泛，本文僅討論單一酶法提取，本研究將進(jìn)一步探討復(fù)合酶法［11］提取，以期獲得更好的提取工藝，提高提取效率。

滁菊多糖抗氧化試驗(yàn)表明，從藥渣中提取的滁菊多糖具有較好的抗氧化性。其中，對(duì)DPPH自由基的清除效果較好，具有較強(qiáng)的還原力，且隨著濃度的增大還原力逐漸增強(qiáng)。與清除超氧陰離子自由基相比，同濃度的滁菊多糖對(duì)DPPH自由基清除率更高。清除作用機(jī)理可能由于多糖分子容易捕獲并結(jié)合自由基，自由基濃度下降，因此顯現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，隨著濃度升高，清除能力逐漸飽和。而滁菊多糖清除超氧陰離子自由基可能是由于多糖分子的半縮醛羥基與超氧陰離子自由基發(fā)生氧化還原作用［12］，而前者是具有還原性的。滁菊多糖的抗氧化性可能是其具有諸多功能的作用機(jī)理之一，但目前對(duì)于抗氧化性能的研究還停留在初步階段，有待進(jìn)一步深入研究。滁菊作為中國(guó)傳統(tǒng)的茶飲品和中藥材，具有廣闊的應(yīng)用前景和工業(yè)價(jià)值，本研究將對(duì)滁菊多糖的結(jié)構(gòu)和組成作進(jìn)一步分析，為滁菊合理化生產(chǎn)和滁菊多糖作為天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)提供理論參考。

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