丁江水，鄧英虎

(1.青陽縣人民醫(yī)院 骨科，安徽 池州 242800;2.銅陵市人民醫(yī)院 骨科，安徽 銅陵 244000)

目前骨肉瘤治療方法通常為手術(shù)治療并輔以化療，5年生存率為50% ～80%［1］。但迄今為止我們?nèi)圆煌耆宄侨饬龅姆肿影l(fā)病機(jī)理。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種高度保守的長度約22～24個(gè)堿基的非編碼單鏈小RNA，它能通過與互補(bǔ)的mRNA序列結(jié)合，從而導(dǎo)致目的mRNA的降解和抑制蛋白的翻譯［2］。研究表明，有98種miRNA基因定位于與腫瘤相關(guān)的脆弱位點(diǎn)或基因組區(qū)域［3－4］。它通過調(diào)控靶基因參與信號通路，從而影響腫瘤的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和血管生成，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［5－6］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a在人多種正常組織中均高表達(dá)，但在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)下降或不表達(dá)，揭示miR-30a在惡性腫瘤中是一種潛在的抑癌基因［8－10］。本研究檢測了人骨肉瘤組織中miR-30a的表達(dá)水平，構(gòu)建miR-30a前體的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS中，應(yīng)用熒光定量PCR檢測了miR-30a在U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)，和流式細(xì)胞技術(shù)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株的凋亡情況，分析miR-30a對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人骨肉瘤組織和正常肌肉組織由銅陵市人民醫(yī)院和青陽縣人民醫(yī)院骨科提供。所有組織標(biāo)本的處理均經(jīng)過銅陵市人民醫(yī)院或青陽縣人民醫(yī)院倫理委員會討論通過。RIPA-1640培養(yǎng)基(Gibco)、南美胎牛血清(Gibco)、轉(zhuǎn)染用無血清培養(yǎng)基 OPTI-MEM(Gibco)，Trizol(Invitrogen)、Purelink HiPure Plasmid Miniprep Kit(Invitrogen)、X-treme GENE HP DNA transfection reagent(Roche)、Cell Counting Kit-8(日本同仁)、miScript Reverse Transcription Kit(Qiagen)、miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)、miScript Primer Assays(MS00007350)(Qiagen)、Guava Nexin Reagent(Millipore)，premiR-30a真核表達(dá)載體由廣州復(fù)能基因有限公司構(gòu)建，以插入一段無效序列的載體作為無效對照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hsa-miR-30a在人骨肉瘤組織中的表達(dá)水平檢測 術(shù)中將切除的骨肉瘤組織和正常肌肉組織分別剪碎，部分組織于液氮中速凍后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ肨rizol一步法提取骨肉瘤組織和正常肌肉的總RNA(包括microRNA)，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并測RNA濃度。按照miScript Reverse Transcription Kit說明書將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用Qiagen miScript Primer Assays及 miScript SYBR Green PCR kit擴(kuò)增 miRNA-30a片段，并使用RNU6B作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 15 min，94℃變性 15 s，55℃退火 30 s，70℃熒光檢測30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。70～95℃繪制溶解曲線，根據(jù)Cp值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取 將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEZX-MR04-pre-miR-30a及無效對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板(Amp+)上，并在37℃條件下倒置培養(yǎng)12～16 h。次日從平板上挑取菌落至LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中培養(yǎng)，并按Invitrogen Purelink HiPure Plasmid Miniprep Kit試劑盒說明書提取質(zhì)粒，最后用NaRo Drop 2000核酸測定儀(Thermo)測定質(zhì)粒濃度。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 U2-OS細(xì)胞用含10%胎牛血清的RIPA-1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。向6孔板各孔中加入濃度為1×105細(xì)胞/ml的U2-OS細(xì)胞2 ml，培養(yǎng)24 h待貼壁細(xì)胞達(dá)到70% ～80%匯合度時(shí)，按照Roche X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，設(shè)無效對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組。轉(zhuǎn)染后16 h更換含10%胎牛血清的RIPA-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測miR-30a的表達(dá)。

1.2.4 檢測 hsa-miR-30a在 U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)pEZX-MR04載體中有eGFP標(biāo)簽，發(fā)綠色熒光，所以用熒光顯微鏡觀察 eGFP的表達(dá)情況，可檢測miR-30a的表達(dá)。另外，可用熒光定量PCR檢測U2-OS細(xì)胞miR-30a的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染pEZX-MR04-pre-miR-30a載體48 h后，用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行熒光定量PCR檢測，操作步驟同 1.2.1。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測U2-OS細(xì)胞的凋亡 U2-OS細(xì)胞于6孔板轉(zhuǎn)染pEZX-MR04-pre-miR-30a載體72 h后，用胰酶消化液將細(xì)胞消化下來，800 g離心后用100 μl含10%胎牛血清的RIPA-1640培養(yǎng)基輕輕重懸，然后加入100 μl Guava Nexin Reagent，避光孵育20 min。然后上Guava easyCyte 6-2L流式細(xì)胞儀(Millipore)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，熒光定量PCR結(jié)果采用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-30a在人骨肉瘤組織和U2-OS細(xì)胞中的表達(dá) 與5例正常肌肉組織相比，5例骨肉瘤組織的miR-30a表達(dá)水平降低(P＜0.01，圖1)。骨肉瘤細(xì)胞U2-OS在轉(zhuǎn)染pre-miR-30a表達(dá)載體和無效載體后，熒光顯微鏡下可見大量發(fā)綠色熒光的陽性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上(圖2)。pre-miR-30a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的miR-30a表達(dá)水平顯著增高，與無效對照組及轉(zhuǎn)染試劑對照組細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.01，圖3)。

圖1 miR-30a在正常肌肉組織和骨肉瘤組織中的表達(dá)水平Fig 1 Expression levels of miR-30a in normal muscle tissue and in osteosarcoma

2.2 上調(diào)miR-30a表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞U2-OS凋亡的促進(jìn)作用 轉(zhuǎn)染pre-miR-30a表達(dá)載體72 h后，骨肉瘤細(xì)胞U2-OS經(jīng)Annexin V和7-AAD染色后用流式細(xì)胞儀檢測，早期凋亡率分別為(26.32±2.54)%，與無效對照載體組的凋亡率(9.35±1.64)%，和轉(zhuǎn)染試劑對照組細(xì)胞的凋亡率(0.21±0.06)% 相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，圖4)。

圖2 熒光顯微鏡觀察U2-OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-miR-30a表達(dá)載體后情況(×100)Fig 2 Expression of U2-OS cells transfected with the expression vector pre-miR-30a by fluorescence microscopy

圖3 熒光定量PCR檢測miR-30a在骨肉瘤細(xì)胞U2-OS中的表達(dá)Fig 3 Detection of miR-30a expression in osteosarcoma cells in U2-OS by fluorescence quantitative PCR

圖4 流式細(xì)胞儀檢測上調(diào)miR-30a表達(dá)水平后對U2-OS細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 Effect on apoptosis of U2-OS cells in flow cytometry after up-regulated miR-30a expression level

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性表達(dá)的非編碼單鏈小RNA，其前體:初級 miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)和前體 miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)可在Drosha復(fù)合體和Dicer酶的作用下在胞漿中由剪切成為成熟miRNA，并與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合并降解靶mRNA，從而降低靶基因mRNA水平或直接抑制其蛋白翻譯過程［2］，調(diào)控生命過程的多個(gè)環(huán)節(jié)，包括器官發(fā)育、物質(zhì)代謝、細(xì)胞分化、凋亡和癌變。近年來發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、甘肝癌等多種惡性腫瘤中部分miRNA的表達(dá)水平異常，揭示miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用［11－15］。

近期研究表明，miR-30a參與了多種癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。Baraniskin等發(fā)現(xiàn)恢復(fù)miR-30a在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)后可抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并使細(xì)胞停留在G1期，提示miR-30a可能可作為治療結(jié)腸癌的分子靶標(biāo)之一［8］。Cheng等上調(diào)miR-30a在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低，且miR-30a低表達(dá)的乳腺癌病人大多存在癌癥晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高病死率和高復(fù)發(fā)率等現(xiàn)象［9］。Kumarswamy等還發(fā)現(xiàn)了miR-30a與非小細(xì)胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程相關(guān)，高表達(dá)miR-30a能抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。本研究發(fā)現(xiàn)與正常肌肉組織相比，miR-30a在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯下降，與其他腫瘤中的報(bào)道一致。本研究構(gòu)建了miR-30a前體的真核表達(dá)載體并成功將其轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞U2-OS中，檢測出骨肉瘤細(xì)胞中miR-30a的上調(diào)表達(dá)。

細(xì)胞凋亡過程是一個(gè)多步驟、多基因失調(diào)的過程，有許多蛋白參與其中。研究證實(shí)，miR-30a的靶蛋白之一為denticleless protein homolog(DTL)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;DTL的表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)TP53和CDKN1A的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及使細(xì)胞停留在G1期［8］。推測miR-30a可能直接或間接錨定其中某些抗凋亡蛋白的mRNA 3'UTR區(qū)，使蛋白合成抑制或減少，從而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。本研究中，流式細(xì)胞技術(shù)檢測成功轉(zhuǎn)染后的U2-OS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡明顯增加。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功將miR-30a真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞U2-OS，且穩(wěn)轉(zhuǎn)株可有效表達(dá)，研究結(jié)果表明，骨肉瘤細(xì)胞中miR-30a的過表達(dá)可明顯增加U2-OS細(xì)胞的凋亡，但其具體機(jī)制尚未清楚，且miR-30a與骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的關(guān)系亦未見相關(guān)報(bào)道，值得進(jìn)一步研究，以便為骨肉瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

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