程艷玲，吳志奎

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

1 β-地中海貧血的發(fā)病機(jī)理

1.1 β-地中海貧血是常染色體單基因遺傳性疾病

β-地中海貧血是世界上發(fā)病率較高的常染色體單基因遺傳性疾病，其發(fā)病機(jī)理是位于11號(hào)染色體上控制β-珠蛋白鏈合成的基因缺失或突變，導(dǎo)致機(jī)體不能正常合成β-珠蛋白鏈。正常人體β-珠蛋白基因簇由分布在11號(hào)染色體中部的調(diào)控區(qū)及功能區(qū)構(gòu)成，調(diào)控區(qū)主要為β-LCR，其功能基因按5'ε-Gγ-Aγ-δ-β 3'排列，每條染色體上只有 1 個(gè) β-珠蛋白基因(見圖1)。

圖1 人體不同時(shí)期的珠蛋白表達(dá)［1］

1.2 γ-珠蛋白與β-珠蛋白的生理作用比較

γ-珠蛋白較β-珠蛋白有稍微高的氧結(jié)合力，用γ-珠蛋白替代β-珠蛋白的個(gè)體同樣表現(xiàn)出健康的狀態(tài)。β-地中海貧血尚無(wú)法根治，目前較為普遍的治療方法主要是常規(guī)輸血和規(guī)律使用除鐵劑以及相應(yīng)的對(duì)癥處理，骨髓和干細(xì)胞移植由于配型和髓源限制，很難在臨床上普及，基因治療雖然是未來(lái)的治療方向，但同源重組問(wèn)題仍未解決，臨床應(yīng)用尚待時(shí)日。

2 表觀遺傳修飾

近年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，除結(jié)構(gòu)基因外，基因外編碼即表觀遺傳學(xué)愈來(lái)愈引起科研工作者的廣泛關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)因素在地中海貧血的發(fā)生中起到重要作用。

2.1 表觀遺傳學(xué)的發(fā)展

1939年，生物學(xué)家Conrad.H.Waddington首先在《現(xiàn)代遺傳學(xué)導(dǎo)論》中提出了epigenetics這一術(shù)語(yǔ)。1942年，他在研究基因型產(chǎn)生表型的過(guò)程中，把表觀遺傳學(xué)描述為1個(gè)控制從基因型到表現(xiàn)型的機(jī)制［2，3］。1975 年，Holliday.R 對(duì)表觀遺傳學(xué)進(jìn)行了較為準(zhǔn)確地描述，認(rèn)為表觀遺傳學(xué)不僅在發(fā)育過(guò)程中，還在成體階段研究可遺傳的基因表達(dá)改變，這些信息可經(jīng)有絲分裂、減數(shù)分裂在細(xì)胞和個(gè)體間世代傳遞［4］。

2.2 表觀基因組學(xué)與經(jīng)典DNA編碼遺傳學(xué)的區(qū)別與聯(lián)系

經(jīng)典基因組遺傳學(xué)是基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化(如基因突變、基因丟失等);表觀遺傳學(xué)則是基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾(甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等)以及非編碼微小RNA作用［5］。經(jīng)典基因組學(xué)具有高度穩(wěn)定性的特點(diǎn);表觀基因組學(xué)在一定條件下是可逆的，處于亞穩(wěn)定狀態(tài)并受多種因素影響，表觀遺傳在人體不同部位組織中并不相同，隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)生變化，容易受到外界環(huán)境因素的影響［6］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，人類表觀遺傳學(xué)模式受到環(huán)境因素的影響，如吸煙、營(yíng)養(yǎng)狀況、嗜酒、環(huán)境污染、壓力等，且表觀遺傳改變具有可遺傳性。

表觀遺傳學(xué)在DNA向RNA轉(zhuǎn)錄并翻譯為蛋白質(zhì)的過(guò)程中起非常重要的作用，遺傳調(diào)控(包括基因轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯、翻譯后修飾)與表觀遺傳調(diào)控共同參并貫穿生命整個(gè)過(guò)程，使機(jī)體能夠協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)［4］。

遺傳信息提供合成生命必需的蛋白質(zhì)模板，而表觀遺傳信息則提供何時(shí)、何地以及如何應(yīng)用遺傳信息的指令，兩者既相互區(qū)別又相互依存。

3 表觀遺傳學(xué)與β-地中海貧血內(nèi)在聯(lián)系研究

3.1 DNA甲基化(DNA methylation)與β-地中海貧血

DNA甲基化是指甲基化酶(methylase，DNMTS)從諸如葉酸和維生素B12等基本營(yíng)養(yǎng)成分中取得甲基后，轉(zhuǎn)移到DNA序列中的堿基上，使之發(fā)生甲基化作用［8］。人類 DNA甲基化通常是在胞嘧啶(cytosine)堿基5'位碳原子上引入甲基(CH3-)，胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5 mC)從而改變DNA大分子空間構(gòu)象，影響基因表達(dá)。對(duì)人類β-珠蛋白基因簇中ε、γ、β各基因在個(gè)體發(fā)育不同階段的DNA甲基化研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ε、γ、β基因分別在卵黃囊、胎兒肝臟、成人骨髓造血階段表達(dá)時(shí)，各表達(dá)基因的啟動(dòng)子區(qū)DNA呈低甲基化狀態(tài)，其他沉默基因啟動(dòng)子區(qū)DNA呈高甲基化狀態(tài)，即DNA甲基化抑制珠蛋白表達(dá)，而去甲基化則能夠使珠蛋白基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。

3.2 組蛋白共價(jià)修飾作用與β-地中海貧血

組蛋白的共價(jià)修飾可通過(guò)影響蛋白質(zhì)與DNA雙鏈的親和性，從而改變?nèi)旧|(zhì)的松散和凝集狀態(tài)。組蛋白修飾的機(jī)制主要有:其一，能改變組蛋白的電荷，從而改變組蛋白與DNA結(jié)合的特性;其次，組蛋白修飾能夠募集專一蛋白復(fù)合到它們表面，從而發(fā)揮作用。

3.2.1 組蛋白甲基化作用 組蛋白甲基化作用是在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTS)催化作用下完成的，組蛋白甲基化是可逆的，且甲基化標(biāo)記基因的表達(dá)調(diào)控作用可以完全相反，主要取決于甲基化的位點(diǎn)和甲基化的程度。

3.2.2 組蛋白乙?；饔?組蛋白乙?；饔弥饕山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATS)和組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDATS)協(xié)調(diào)進(jìn)行。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATS)主要在H3、H4的賴氨酸上加乙?；?，而組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDATS)作用正好相反。組蛋白乙?；c去乙酰化彼此之間相互作用，而這些修飾作用都能夠改變基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。對(duì)表達(dá)胎兒γ-珠蛋白基因的K562細(xì)胞表觀遺傳修飾分析顯示，從基因座位調(diào)控區(qū)到胚胎、胎兒基因都存在廣泛乙?；?，研究表明珠蛋白乙酰化可以促進(jìn)γ-珠蛋白的合成。

3.3 β-LCRs調(diào)控區(qū)域與β-珠蛋白基因表達(dá)關(guān)系

β-珠蛋白基因的正常表達(dá)受其相應(yīng)位點(diǎn)調(diào)控區(qū)域(β-LCR)的作用，該調(diào)節(jié)控制區(qū)域由4個(gè)紅細(xì)胞生成特異性脫氧核糖核苷酸酶高敏位點(diǎn)(HS1、HS2、HS3、HS4)組成，研究表明在β珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，LCRs區(qū)域與功能基因的位置距離更加接近，而與胚胎期表達(dá)的ε基因以及胎兒期表達(dá)的γ-基因相距較遠(yuǎn)(見圖2)。

圖2 β-LCRs調(diào)控區(qū)域位置變化［9］

3.4 紅系轉(zhuǎn)錄因子與表觀遺傳學(xué)修飾作用

紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、NF-E2是紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的重要部分，在血紅蛋白生成和珠蛋白基因調(diào)控中都起重要作用，且GATA-1、NF-E2能夠誘導(dǎo)珠蛋白修飾。

此外，研究較多的還有BCL11A、KLF(EKLF)以及C-Myb。研究表明，BCL11A能夠抑制γ-珠蛋白合成，在成人體內(nèi)高表達(dá)，但在胚胎或胎兒期則處于低水平狀態(tài);KLF能激活β-珠蛋白基因抑制γ-珠蛋白基因，激活γ-珠蛋白沉默因子BCL11A;c-Myb通過(guò)KLF1激活BCL11A途徑抑制珠蛋γ-白表達(dá)(見圖3)。

圖3 影響γ-珠蛋白鏈基因的網(wǎng)絡(luò)模式圖［1］

3.5 非編碼RNA(Non-coding RNAs)的表觀遺傳修飾

非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子，分為看家非編碼RNA和調(diào)控非編碼RNA，其中具有調(diào)控作用的非編碼RNA按其大小主要分為兩類:短鏈非編碼 RNA(包括 siRNA、miRNA、piRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(lncRNA)［10～12］。

miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類單鏈非編碼RNA，具有高度保守性、時(shí)序表達(dá)和組織表達(dá)特異性，通過(guò)對(duì)靶mRNA的降解和翻譯抑制而在動(dòng)物和植物中起著重要的調(diào)控作用，屬于廣義的表觀遺傳學(xué)范圍。miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、維持細(xì)胞中DNA甲基化水平或改變組蛋白修飾、染色體結(jié)構(gòu)等途徑調(diào)控表觀遺傳，如一些miRNA抑制組蛋白脫乙?；傅谋磉_(dá)［13］。

4 表觀遺傳學(xué)治療β-地中海貧血研究

目前針對(duì)β-地中海貧血的表觀遺傳學(xué)治療主要集中在重新激活成人體內(nèi)γ-珠蛋白鏈基因，γ-鏈的增加可降低血紅蛋白表達(dá)不平衡帶來(lái)的危害，使γ-珠蛋白替代缺失的β-珠蛋白鏈，平衡相對(duì)過(guò)剩的α-珠蛋白鏈，從而減少紅細(xì)胞損傷和臨床并發(fā)癥。人γ-珠蛋白基因的激活表達(dá)是目前治療這類疾病的重要策略，使用的藥物主要包括以下兩類［8］。

4.1 DNA甲基酶抑制劑

主要有5-氮胞苷(5-azacytidin)和地西他濱(Decitabin，5-氮胞苷因其有較強(qiáng)的骨髓毒作用，臨床應(yīng)用受到限制;地西他濱是目前已知最強(qiáng)的DNA甲基化特異性抑制劑，能夠通過(guò)阻斷DNA甲基化從而激活基因轉(zhuǎn)錄。

4.2 組蛋白去乙?；敢种苿?/h3>

主要有丁鹽酸，丁鹽酸能夠促進(jìn)γ-珠蛋白基因表達(dá)是基于促進(jìn)組蛋白修飾，通過(guò)降低γ-珠蛋白基因的DNA甲基化水平、增強(qiáng)紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1表達(dá)發(fā)揮作用。組蛋白去乙酰酶抑制劑苯丁酸鈉(PB)能明顯抑制白血病細(xì)胞Kasumi-1的生長(zhǎng)。其次有Apicidin，一類環(huán)化四胎類物質(zhì)，最初作為抗真菌藥物開發(fā)。Apicidin能夠結(jié)合組蛋白去乙?；?HDAC)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合組蛋白去乙?；?，使組蛋白過(guò)度乙?；?。臨床發(fā)現(xiàn)，Apicidin在誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系方向轉(zhuǎn)化時(shí)，K562細(xì)胞中H3、H4高度乙?；殡S著γ-基因mRNA表達(dá)水平升高。

5 中醫(yī)藥治療地中海貧血表觀遺傳學(xué)機(jī)理研究

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室吳志奎教授課題組根據(jù)“腎藏精生髓，髓生血”理論創(chuàng)制了“益髓生血顆粒”用來(lái)治療地中海貧血，臨床上取得了可重復(fù)的療效。大量臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示其療效的可能分子機(jī)制是［14］:補(bǔ)腎益髓中藥治療β-地中海貧血不改變患者的基因突變型，能明顯提高珠蛋白鏈γ-/γ-+β的比值，促進(jìn)γ-珠蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)HbF合成，從而代替了由于β-珠蛋白基因缺失導(dǎo)致的功能缺陷，平衡相對(duì)過(guò)剩的α-珠蛋白鏈，緩解臨床癥狀和減少并發(fā)癥。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院沈自尹教授就該課題組的研究作了如下評(píng)價(jià):本研究首次在國(guó)際上用藥物對(duì)單基因遺傳病實(shí)現(xiàn)不是改變基因結(jié)構(gòu)，而是修飾、調(diào)節(jié)基因表達(dá)與基因產(chǎn)物功能獲得無(wú)副作用和后遺癥的顯著療效［15］。

5.1 益髓生血顆粒對(duì)不同發(fā)育階段小鼠血紅蛋白珠蛋白表達(dá)的影響研究

吳志奎課題組發(fā)現(xiàn)在小鼠的紅系發(fā)育過(guò)程中，只存在胚胎(βh1，ε)→成年(βminor，βmajor)珠蛋白開關(guān)，與人β-珠蛋白基因存在從胚胎(ε)→胎兒(γ)→成人(β)2個(gè)基因開關(guān)不同，小鼠胎肝和骨髓時(shí)期都屬于紅系發(fā)育的成年期。開始胎肝造血時(shí)(孕11 d左右)，小鼠βminor珠蛋白基因的表達(dá)占主導(dǎo)地位，在發(fā)育過(guò)程中其表達(dá)水平逐步降低，而βmajor珠蛋白基因的表達(dá)量相應(yīng)增加并最終占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。從這一角度來(lái)看，βminor基因與人的珠蛋白基因相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，隨著小鼠胚胎的發(fā)育，正常對(duì)照組的孕鼠(孕14 d)、胎鼠(孕21 d)和成年鼠中βminor珠蛋白基因的表達(dá)逐漸降低;而經(jīng)中藥干預(yù)后，對(duì)照組胎鼠(孕21 d)珠蛋白程序性表達(dá)有所改變，其表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);而正常成年鼠經(jīng)中藥干預(yù)后，βminor珠蛋白基因表達(dá)量也明顯升高(P＜0.01)。這一結(jié)果與臨床研究存在高度一致。由此說(shuō)明，中藥治療β-地中海貧血的分子機(jī)制之一是可以通過(guò)激活已關(guān)閉的γ-珠蛋白基因，表達(dá)γ-珠蛋白，促進(jìn)HbF的生成，緩解因?yàn)棣?珠蛋白生成障礙所致的正常血紅蛋白生成不足，使患者的貧血情況得到改善［16］。

5.2 從基因修飾的DNA甲基化水平研究補(bǔ)腎生血藥作用的分子機(jī)理

吳志奎課題組用3H-SAM甲基摻入測(cè)定DNA甲基化酶活力，用HPLC分析鼠肝DNA堿基，用3HUTP摻入測(cè)定不同甲基化水平DNA模板的體外轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，DNA甲基化酶活力和甲基化水平隨增齡而降低，而體外轉(zhuǎn)錄與鼠齡呈正相關(guān)，補(bǔ)腎生血藥能明顯提高老齡大鼠肝DNA甲基化酶活力和甲基化水平，能提高鼠腦DNA甲基化酶活力，提高該酶對(duì)熱穩(wěn)定性和對(duì)鹽的耐受性［17］。

5.3 益髓生血顆粒對(duì)紅系作用因子的作用

吳志奎課題組在對(duì)中藥治療對(duì)β-珠蛋白基因簇位點(diǎn)調(diào)控區(qū)高敏位點(diǎn)2與核蛋白結(jié)合作用的影響研究中發(fā)現(xiàn)，中藥可能改變?chǔ)?珠蛋白基因簇反式作用因子GATA的表達(dá)，使其和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合模體GATA盒的結(jié)合作用發(fā)生改變，從而改變?chǔ)?珠蛋白基因簇的表達(dá)、誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)、HbF合成增加起到治療作用［18］。

5.4 疾病的環(huán)境因素與表觀遺傳學(xué)調(diào)控

吳志奎課題組在對(duì)廣西高發(fā)地區(qū)病人的多次觀察中還發(fā)現(xiàn)，地中海貧血患者夏季貧血癥狀加重，冬季病情則相對(duì)較輕［19］。這種疾病的季節(jié)性差異是否與環(huán)境因素改變其內(nèi)在的表觀調(diào)控因素有關(guān)尚需進(jìn)一步探討研究，如果該假說(shuō)成立，也可以從側(cè)面解釋氣候?qū)τ谌梭w以及疾病影響的可能機(jī)制。

6 研究展望

對(duì)于地中海貧血的表觀遺傳學(xué)治療主要集中在激活關(guān)閉的γ-基因，但影響γ-基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)γ-珠蛋白的各種表觀遺傳因素的作用機(jī)制尚需進(jìn)行更深入的探討［20］，只有對(duì)其各影響因素相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有清晰的認(rèn)識(shí)，對(duì)β-地中海貧血的治療才能有更進(jìn)一步的進(jìn)展。

自2003年表觀基因組學(xué)計(jì)劃(Human epigenome project，HEP)實(shí)施以來(lái)，有關(guān)表觀遺傳研究的各種方法開始不斷出現(xiàn)，具有代表性的是DNA甲基化技術(shù)的發(fā)展，主要包括依賴于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶技術(shù)，依賴于DNA序列分析的檢測(cè)技術(shù)和依賴于甲基化芯片、質(zhì)譜的檢測(cè)技術(shù)，除上述方法外，表觀基因組學(xué)的研究方法還有高效液相色譜(HPLC)、MBD 柱層析法等［21，22］。隨著研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，必將涌現(xiàn)出更多較為完善的研究方法，從而為表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)的發(fā)展以及為揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

目前表觀遺傳學(xué)的研究仍然面臨著很多問(wèn)題，表觀遺傳學(xué)變化與環(huán)境以及疾病之間具有怎樣的內(nèi)在作用聯(lián)系，各種表觀遺傳機(jī)制之間的內(nèi)在聯(lián)系以及它們之間的相互影響作用機(jī)制仍然需要深入探討，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步表觀遺傳作用對(duì)疾病的影響正逐步被揭示［23］。

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