張國民，黃 娟，寧炯杰，李筠芝，莫新民，劉慧萍

(湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織微細結(jié)構(gòu)破壞為特征，繼而導致骨脆性增加和骨折危險性增高的1種全身性骨骼疾病。我國原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率男性為60.72%，女性現(xiàn)已高達90.48%［1］。如何積極預防老年人特別是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥，提高人民生命質(zhì)量，已成為當前亟待解決的課題。壯骨止痛方由補骨脂、淫羊藿、枸杞、牛膝等7味藥物組成，具有補腎氣、溫腎陽、兼顧滋補肝腎陰精、壯骨止痛的功效［2］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只3月齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量250 g左右，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(粵)2008-0002)。

1.2 藥品及試劑

壯骨止痛方全方提取物由中南大學藥理學實驗室提供;E2放免試劑盒(批號HY-032)，北京華英生物技術(shù)研究所;一抗:OPG(批號BA1475)、SABC試劑盒(批號 SA1022)、DAB顯色試劑盒(批號AR1022)，均購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 主要儀器

r放射免疫計數(shù)器(GC-1500)、JY3002型電子天平、超低溫溫冰箱、LEICA DM LB2型雙目顯微鏡、HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋、Haier醫(yī)用微波爐、LKB-Ⅲ型超薄切片機、JEOL-1230型透射電鏡、MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)、Motic B5顯微攝像系統(tǒng)等。

2 方法

2.1 造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分出空白組和假手術(shù)組各15只，除空白組外，其余均用2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉，在無菌條件下從距離大鼠第一胸腰椎外側(cè)1 cm處縱向切開皮膚及兩側(cè)肌肉，摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅在卵巢周圍切除相應(yīng)重量的脂肪，分兩層縫合傷口并用生理鹽水擦洗干凈血跡，術(shù)后連續(xù)3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠4萬 u/d，飼養(yǎng)于室溫 23～25℃、相對濕度50% ～70%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水［3］。

2.2 動物分組

術(shù)后1周將模型大鼠隨機分為模型組、壯骨止痛方全方組，加上假手術(shù)組和空白組共4組，每組15只。

2.3 給藥方法

術(shù)后1周開始給藥，各組給藥劑量均嚴格按照臨床給藥劑量進行人鼠體表面積換算后，根據(jù)各藥的臨床給藥劑量的提取量進行確定，并且根據(jù)實際情況把藥物制備成油相和水相。給藥劑量為:油相0.4 mL/100 g體質(zhì)量，水相0.6 mL/100 g體質(zhì)量，為消除差異，水相加灌油中王牌的植物油，油相加灌冷的白開水，即各組油和水的每次給藥總劑量為1 mL/100 g體質(zhì)量。模型組、空白組、假手術(shù)組只灌胃相應(yīng)體積的植物油和冷開水。連續(xù)灌胃13周，每10 d稱1次體質(zhì)量，13周之后按文獻要求處死動物，并取材檢測相關(guān)指標［2］。

2.4 檢測指標

連續(xù)灌胃13周，每10 d稱1次體質(zhì)量，13周之后所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹部切口分離腹主動脈，用負壓采血管采血10 mL，離心后分離血清檢測雌二醇;取右側(cè)脛骨用5%的硝酸脫鈣1周，2.5%戊二醛固定24 h以上，超薄切片厚約500埃，電子染色，觀察骨組織的超微結(jié)構(gòu);取左側(cè)股骨，用4%的多聚甲醛固定48 h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，石蠟包埋，用Shandon切片機間斷連續(xù)切片，切片厚4 um，采用SABC法檢測OPG在骨組織中的表達，染成棕黃色為陽性表達。每張免疫組化的切片選5個視野，參與計算機圖像分析。采用北航MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，在40倍物鏡下行陽性面積計數(shù)，平均面密度測定。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較方差齊時用方差分析，方差不齊時用軼和檢驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 對去勢雌性骨質(zhì)疏松癥大鼠血清E2影響

表1 各組對雌鼠血清E2的影響(±s)

注:與模型組比較:▲P＜0.05;▲▲P＜0.01

組別 例數(shù) E2(pg/ml)15 2.82±0.10全 方 提 取 組 15 5.81±1.12▲空 白 對 照 組 15 4.00±0.36▲假 手 術(shù) 組 15 4.03±0.30模型組▲▲

與模型組比較，各組都能明顯升高大鼠血清E2含量(P＜0.05)。

3.2 對去勢骨質(zhì)疏松癥模型雌鼠右脛骨骨細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1～5顯示，模型組大部分骨細胞胞核及胞漿濃縮明顯，骨細胞突起明顯減少，骨陷窩橢圓形;壯骨止痛方組骨細胞較正常，骨細胞突起無明顯改變，骨陷窩明顯縮小呈扁橢圓形;假手術(shù)組骨間質(zhì)致密，骨細胞內(nèi)部分線粒體存在空泡變性，骨陷窩較小;空白組骨細胞線粒體無變性，骨細胞突起無改變，骨陷窩較小。

3.3 OPG的表達

表2顯示，采用免疫組織化學檢測OPG。結(jié)果判斷，陽性細胞的細胞膜和胞漿被染成棕黃色(見圖6～10)，與陰性細胞形成鮮明對比。切片于光鏡下400倍放大，經(jīng)顯微攝像系統(tǒng)隨機攝取5個視野，通過圖像分析系統(tǒng)檢測每個視野內(nèi)陽性染色細胞面密度并取其平均值。所得數(shù)據(jù)用方差分析進行統(tǒng)計處理。

表2 各組大鼠股骨組織OPG表達的平均面密度表達比較(±s)

表2 各組大鼠股骨組織OPG表達的平均面密度表達比較(±s)

注:與模型組比較:★P＜0.01

組別 例數(shù)OPG模 型 組15 10.32±1.01全 方 提 取 組 15 19.82±1.98★空 白 對 照 組 15 17.24±2.11★假 手 術(shù) 組 15 17.59±2.16★

與模型組比較，壯骨止痛方組能夠顯著增加大鼠OPG的平均面密度(P＜0.05)。

圖6 ～10 OPG免疫組化染色

4 討論

骨組織是雌激素的靶器官之一，這一觀點正由日漸增多的研究所證實，雌激素對于維護骨吸收及骨形成的平衡至關(guān)重要［4］。實驗證明，補腎中藥能夠增加成骨細胞上雌激素受體(ER)，具有雌激素樣作用，針對腎虛實質(zhì)使下丘腦-垂體-性腺之間保持動態(tài)平衡，這也是補腎中藥治療骨質(zhì)疏松癥的可能機制之一。壯骨止痛方組方中補骨脂、枸杞等藥物都具有雌激素樣作用［5］。正常情況下，破骨細胞形成刺激因子OPGL及抑制因子OPG的表達是平衡的，破骨細胞的分化發(fā)育和激活受到巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)、骨保護蛋白 (OPG)和骨保護蛋白配體(OPGL)3種信號分子的調(diào)節(jié)［6］，使骨形成和骨吸收維持平衡狀態(tài)。因而，OPG和OPGL構(gòu)成了直接影響破骨細胞分化及其功能、調(diào)節(jié)骨再建的細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也是其他許多細胞因子介導破骨細胞和骨吸收的最終和共有通路?，F(xiàn)有研究表明，OPG基因敲除的小鼠表現(xiàn)嚴重骨質(zhì)疏松，轉(zhuǎn)OPG基因小鼠可引起骨骼彌漫性硬化［7］，表明OPG對骨密度具有重要調(diào)節(jié)作用。本實驗模型組OPG較空白對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛方全方提取物能改善去勢骨質(zhì)疏松模型大鼠機體激素代謝紊亂，增加雌二醇含量，提高OPG含量而起到抗骨質(zhì)疏松的作用;可顯著增加去勢雌鼠左股骨骨小梁密度和左股骨頸梁髓比，改善脛骨骨組織超微結(jié)構(gòu)，從而改善骨基質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，加強骨生物力學性能。

［1］朱建民，程秦娣.絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2006，12(4):234-236.

［2］張國民，莫新民.壯骨止痛方全方提取物對去勢雌鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2010，16(11):1010-1012.

［3］朱蕾，趙小英，盧興國.去卵巢大鼠骨密度變化與骨髓組織血管生成的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2009，25(9):1801-1805.

［4］Tmuer，C.H.，Sato，M.，nadByrnad，H.U.Raloxiefne Presevres bone srength and bone mass in ovariectiomized rats［J］.Endocrinology，1994a，135:2001-2005.

［5］曾英，莫新民，雷曉明，等.壯骨止痛膠囊對去卵巢雌鼠骨質(zhì)疏松癥骨強度和生物力學的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2007，13(4):292-295.

［6］Turner RT，Wakley GK，Hannon KS，et al.Tamoxifen inhibits osteoclast mediated resorption of trabecular bone in ovarian hormone delicient rats［J］.Endocrinology，1988，112:1146.

［7］Wronski TJ，Cintron M，Doherty AL，et al:Estrogen treatment prevents osteopenia and depresses bone turnover in ovariectomied rats［J］.Endoerinology，1988，123:618.