黃蓉 ，徐小潔，王濤，馮瀅瀅，周麗英，李玲，冀全博，杜楠，葉棋濃

1.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院，北京 100048；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

14-3-3 是一個(gè)高度保守的基因家族，在真核細(xì)胞中廣泛分布，并參與許多重要的細(xì)胞生理過(guò)程,如生長(zhǎng)分化、周期調(diào)控和凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)和遷移，以及惡性腫瘤的形成等[1]。14-3-3 蛋白最初是在哺乳動(dòng)物的大腦中發(fā)現(xiàn)的[2]，目前在哺乳動(dòng)物中至少存在7 個(gè)亞型（β，ε，η，γ，τ，ζ和σ）[3]。14-3-3 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為（25～30）×103，是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白家族[4]，可通過(guò)與靶蛋白結(jié)合，調(diào)控蛋白活性及蛋白胞內(nèi)定位等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞G2/M 期和G1/S 期轉(zhuǎn)換[5]，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-7]。為了深入研究14-3-3 在調(diào)控細(xì)胞周期中的相互作用蛋白，我們從人乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增出14-3-3σ基因的全長(zhǎng)編碼序列，通過(guò)連接原核表達(dá)載體構(gòu)建含14-3-3σ基因的重組質(zhì)粒，在原核系統(tǒng)中表達(dá)并純化得到14-3-3σ蛋白，檢測(cè)其生物活性，為后續(xù)探討14-3-3σ蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)行與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法[8]

1.1 材料

人乳腺文庫(kù)，人胚腎細(xì)胞293T，大腸桿菌DH5α、Rossate，原核表達(dá)載體pGEX-KG 為本室保存；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、高保真Primer STAR HS DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶為TaKaRa 公司產(chǎn)品；VigoFect 為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品；GST-Sepharose 4B珠子購(gòu)自Pharmacia公司；DNA膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒為北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗GST、FLAG 單克隆抗體（mAb）購(gòu)自Sigma 公司；其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；測(cè)序由北京華大基因公司完成。

1.2 人14-3-3σ全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的擴(kuò)增

以人乳腺文庫(kù)為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人14-3-3σ基因序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATG GAGAGAGCCAGTCTGATCCA-3'）和下游引物（5'-CGGAATTCTCAGCTCTGGGGCTCCTGGGG-3'），用Primer STAR HS DNA 聚合酶，PCR 擴(kuò)增人14-3-3σ基因片段（擴(kuò)增條件：95℃5 min 預(yù)變性，然后以94℃ 1 min、62℃ 45 s、72℃ 1 min 行30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖DNA膠檢測(cè)，以瓊脂糖DNA膠回收試劑盒回收。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)鑒定

膠回收的擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，載體pGEX-KG也用相同酶雙酶切，膠回收載體大片段，將2 個(gè)酶切產(chǎn)物用T4DNA 連接酶于16℃連接12 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂LB（Amp抗性）平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，將正確質(zhì)粒送北京華大基因公司測(cè)序。

1.4 融合蛋白GST-14-3-3σ在大腸桿菌中的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-14-3-3σ轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～1.0，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)。

1.5 融合蛋白GST-14-3-3σ的純化

分別將含pGEX-KG-14-3-3σ和含pGEX-KG空載體的Rossate 菌株同時(shí)接種于Amp 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜活化，按2%的比例轉(zhuǎn)接于同種液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，20℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h 以上，離心收集菌體，按Pharmacia 公司提供的方法進(jìn)行GST 融合蛋白的純化，加入裂解液進(jìn)行超聲波破碎，12 000 r/min 離心收集上清，加入適量GST-Sepharose 4B 珠子，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h 后3000 r/min 低速離心收集GST-Sepharose 4B 小顆粒，緩沖液充分洗脫未結(jié)合蛋白質(zhì)，最后以SDSPAGE鑒定純化蛋白。

1.6 GST pull-down分析

將人胚腎細(xì)胞293T 以70%的密度，用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑將帶Flag 標(biāo)簽的AKT 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，4～6 h 后換培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，收細(xì)胞后加入IP 緩沖液500μL，冰上裂解細(xì)胞30 min，將裂解的細(xì)胞于冰上超聲波破碎，12 000 r/min、4℃離心10 min，收集上清，將上步純化的GST-14-3-3σ蛋白及GST 蛋白分別加到細(xì)胞裂解后的上清中，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合3～6 h，3000 r/min 離心收集珠子，緩沖液充分洗脫未結(jié)合蛋白，Western印跡檢測(cè)2種蛋白質(zhì)之間是否存在體外直接相互作用。

2 結(jié)果

2.1 人14-3-3σ編碼區(qū)基因的克隆

以人乳腺文庫(kù)為模板擴(kuò)增獲得約750 bp 的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 重組表達(dá)載體pGEX-14-3-3σ的構(gòu)建與鑒定

將PCR 產(chǎn)物和pGEX-KG 載體分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將2 個(gè)酶切產(chǎn)物用T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒后酶切鑒定，DNA 凝膠電泳可見(jiàn)約750 bp 的條帶（圖2），表明14-3-3σ基因編碼序列已插入pGEXKG 上游的多克隆位點(diǎn)中。DNA 序列測(cè)定結(jié)果顯示與已知序列完全一致，且無(wú)突變發(fā)生（數(shù)據(jù)略）。

圖1 目的基因14-3-3σ的PCR擴(kuò)增

2.3 融合蛋白GST-14-3-3σ的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將pGEX-KG 空載體和鑒定正確的重組質(zhì)粒pGST-14-3-3σ分別轉(zhuǎn)化Rossate 感受態(tài)細(xì)胞，挑選克隆并振蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG 于37℃小量誘導(dǎo)3～4 h 后收集菌體，對(duì)誘導(dǎo)前后的菌體用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定和Western 印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GST-14-3-3σ融合蛋白表達(dá)正確（圖3）。

2.4 融合蛋白GST-14-3-3σ的純化

用GST-Sepharose 4B 親和珠純化獲得融合蛋白GST-14-3-3σ，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定結(jié)果顯示純化效果較好，得到純度較高的GST-14-3-3σ融合蛋白和GST蛋白（圖4）。

2.5 GST pull-down分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，14-3-3蛋白可與AKT 蛋白相互作用，可據(jù)此進(jìn)一步證實(shí)純化的GST-14-3-3σ融合蛋白是否具有生物學(xué)活性。將帶有GST-14-3-3σ的純化珠子與過(guò)表達(dá)Flag-AKT 的293T 細(xì)胞裂解液于4℃結(jié)合3～4 h，用抗Flag-HRP 抗體（1∶2000 稀釋）行Western 印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示AKT 蛋白（Mr約57 000）位置有特異性條帶（圖5），而GST 載體蛋白在同一位置無(wú)此條帶，說(shuō)明14-3-3σ蛋白與AKT 蛋白能夠在體外特異性結(jié)合并相互作用，且GST 標(biāo)簽并不影響14-3-3σ蛋白的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能。

圖2 重組質(zhì)粒GST-14-3-3σ的酶切鑒定

圖3 GST-14-3-3σ融合蛋白的SDS-PAGE（A）和Western印跡（B）

3 討論

哺乳動(dòng)物的14-3-3 蛋白是由2 個(gè)單體連接形成的杯狀二聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體由9個(gè)α螺旋反向平行排列成“L”型結(jié)構(gòu)，其二聚體界面主要由一個(gè)單體的αA 與另一個(gè)單體的αC和αD 構(gòu)成，疏水性殘基和極性殘基共同形成高度保守的兼性溝槽，是調(diào)節(jié)14-3-3 與靶蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9-10]。目前已發(fā)現(xiàn)200 多種蛋白可與14-3-3 蛋白家族成員相互作用，作用方式主要有2 種，即磷酸化和非磷酸化。大多數(shù)蛋白通過(guò)磷酸化途徑與14-3-3蛋白相互作用，這類蛋白主要包括受體蛋白（IGF-1）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白（Cdc25、P53）等[11]；還有少數(shù)蛋白如Bax以非磷酸化途徑和14-3-3蛋白相互作用。

14-3-3 蛋白調(diào)控靶蛋白的方式主要有以下幾種：①改變靶蛋白與其他結(jié)合蛋白的相互作用，如14-3-3 蛋白和Bad 結(jié)合，促使Bad和Bcl-xL/Bcl-2分離[12]；②保護(hù)靶蛋白，使其免于蛋白酶或磷酸酶的作用，如14-3-3 蛋白可使Raf 免于磷酸酶的去磷酸化作用[13]；③抑制或增強(qiáng)靶蛋白的催化活性，如14-3-3蛋白可抑制ASK-1的活性[14]；④調(diào)控靶蛋白核漿轉(zhuǎn)運(yùn)及亞細(xì)胞定位，如14-3-3 蛋白可促進(jìn)Cdc2/周期蛋白B1 復(fù)合物由細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)[15]；⑤作為支架蛋白/接頭蛋白，介導(dǎo)靶蛋白之間的相互作用，如14-3-3 蛋白可以介導(dǎo)Raf和Brc、Raf和PKC 的相互作用[16]；⑥改變靶蛋白DNA 結(jié)合活性，如DNA 損傷后，14-3-3蛋白可與P53結(jié)合，增強(qiáng)P53的DNA結(jié)合活性[17]。以上幾種調(diào)控機(jī)制既可以單獨(dú)作用，也能夠同時(shí)發(fā)生，如14-3-3 蛋白與Bad 結(jié)合后，一方面使Bad 與Bcl-2/Bcl-xL 分離，促使其從細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿，另一方面又可保護(hù)其免受鈣調(diào)磷酸酶的水解作用[18]。

圖4 純化的GST-14-3-3σ融合蛋白的SDS-PAGE分析

圖5 GST pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)14-3-3σ和AKT蛋白的相互作用

AKT 又稱蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，14-3-3σ可負(fù)調(diào)控AKT 進(jìn)而影響細(xì)胞的成瘤性[19]。AKT/PKB是Bad（Bcl-xL/Bcl-2-assosiated death promotor）強(qiáng)有力的激酶，活化的AKT 能在體外使Bad 中與14-3-3 蛋白結(jié)合相關(guān)的S112 或S136 位點(diǎn)磷酸化[20]，導(dǎo)致14-3-3 蛋白與Bad 結(jié)合進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)主要利用AKT 與14-3-3 蛋白的體外相互作用證實(shí)了融合蛋白14-3-3的生物學(xué)活性。

綜上所述，我們用原核表達(dá)系統(tǒng)獲取并純化得到GST-14-3-3σ融合蛋白，用GST pull-down 技術(shù)檢測(cè)了目的蛋白的生物學(xué)活性，為后續(xù)深入研究14-3-3σ蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)行、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞凋亡及腫瘤生長(zhǎng)擴(kuò)散通路中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

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