陳繼軍，馬超，秦海燕，馬瑞，毛曉燕

蘭州生物制品研究所有限公司，甘肅 蘭州 730046

小鼠中和試驗法（NIH 法）是測定狂犬病疫苗效價的標準方法，但該方法耗時長（28 d），結(jié)果易受動物質(zhì)量、操作人員技術(shù)等多種因素的影響，重復(fù)性較差；需要使用大量動物，成本高，也不符合動物人道主義和3R原則[1]，因此WHO建議積極尋找適宜的替代方法進行狂犬病疫苗的效價檢測?？焖倜庖邿晒庠钜种圃囼灒╮apid fluoresce focus inhibition test，RFFIT）能夠特異、快速、靈敏地測定狂犬病毒中和性抗體[2]，是WHO 推薦的抗狂犬病病毒免疫球蛋白測定方法，也是《中華人民共和國藥典》2010 年版收錄的測定方法。我們結(jié)合抗體結(jié)合試驗和免疫熒光灶抑制試驗，初步建立了改良抗體結(jié)合試驗（modified antibody binding test，M-ABT）檢測狂犬病疫苗效價的方法。該方法通過將待檢測疫苗連續(xù)稀釋，與已定量的人抗狂犬病免疫球蛋白標準品于37℃中和1 h，加入80%感染劑量的狂犬病毒CVS-11，于37℃中和1 h 后接種BSR 細胞，培養(yǎng)24 h，經(jīng)丙酮固定后，使用熒光標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體檢測細胞感染情況；同時將疫苗標準品按同樣方法處理并觀察感染情況，通過公式計算待檢測疫苗中的抗原含量。該方法快速、靈敏、重復(fù)性好，無需試驗動物，在48 h 內(nèi)即可獲得結(jié)果，在狂犬病疫苗的生產(chǎn)過程中具有較好的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

12～14 g 雌性昆明系小鼠來自蘭州生物制品研究所實驗動物室；M-ABT 用狂犬病毒CVS-11毒株、BSR 細胞來自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所；狂犬病疫苗參比品、待檢測樣品（純化滅活的aG 株疫苗）、動物實驗用CVS 來自蘭州生物制品研究所疫苗二室；人抗狂犬病免疫球蛋白標準品來自中國藥品生物制品檢定所；FITC 標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體購自北京康思爾泰醫(yī)學科技發(fā)展中心；新生胎牛血清（FBS）購自Sigma 公司；DMEM 及胰蛋白酶購自Gibco 公司；IX-71 倒置熒光顯微鏡為奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 80%細胞感染量CVS-11株測定

取一塊96 孔板，加入100μL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液；取100μL CVS-11 病毒液加入第一孔，混勻；吸出100μL 加入下一孔，混勻；重復(fù)上述步驟，連續(xù)12 孔；每孔取出50μL 稀釋好的病毒，加入另一96 孔板中，再加入50μL 1.0×106/mL BSR細胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)板中的液體，每孔加入200μL PBS 洗1 次，甩干后加入200μL 80%冷丙酮，-20℃固定15 min，棄丙酮，室溫干燥15 min；用PBS 將FITC 標記的抗狂犬病毒核蛋白抗體1∶200稀釋，按1∶1000加入1%伊文思藍，混勻，每孔加入50μL 稀釋好的抗體，37℃孵育1 h；棄去液體后每孔加入200μL PBS，洗3 次；加入25μL 50%甘油，在倒置熒光顯微鏡下觀察，80%細胞被感染孔對應(yīng)的CVS-11濃度即為80%病毒感染劑量。

1.3 改良抗體結(jié)合實驗（M-ABT）

1.3.1 抗原中和 取一塊96 孔板，加入100μL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液；取100μL 待檢樣品加入第一孔，混勻；吸出100μL 加入下一孔，混勻；重復(fù)上述步驟，連續(xù)稀釋8 孔，最后一孔吸出100μL棄去；狂犬病疫苗參比品做同樣處理；每孔加入100μL 0.1 U/mL 的人抗狂犬病毒免疫球蛋白國家標準品；取100μL DMEM 加入100μL FBS作為抗體陰性對照；37℃中和1 h。

1.3.2 病毒感染 每孔取100μL混合液，加入另一塊96 孔板中，加入80%細胞感染量的CVS-11 病毒株50μL；另取含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液100μL，加入80%感染CVS-11 毒株50μL，作為病毒對照；37℃孵育1 h，加入1.0×106/mL 的BSR 細胞50μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.3.3 熒光灶檢測及疫苗效價計算 棄去培養(yǎng)板中的液體，每孔加入200μL PBS 洗1 次，甩干后加入200μL 80%冷丙酮于-20℃固定，15 min 后棄丙酮，室溫干燥15 min；用PBS 將FITC 標記的抗狂犬病毒核蛋白抗體按1∶200稀釋，按1∶1000加入1%伊文思藍，混勻，每孔加入50μL 稀釋好的抗體，37℃孵育1 h；棄去液體后每孔加入200μL PBS，洗3次；加入25μL 50%甘油，在倒置熒光顯微鏡下觀察。抗體陰性對照及病毒對照應(yīng)一致，并感染約80%細胞。記錄各樣品50%感染分界點前后孔內(nèi)細胞感染比例，50%細胞孔中出現(xiàn)熒光灶的最高稀釋度為待測疫苗和疫苗參比品的50%陽性終點。依據(jù)Reed&Muench 法，疫苗效價（U/mL）=（待測疫苗50%陽性終點對應(yīng)稀釋度/疫苗參品50%陽性終點對應(yīng)稀釋度）×（待測疫苗劑量/疫苗參比品劑量）。

1.4 小鼠中和試驗（NIH法）

待檢測樣品及參比品按1∶25、1∶125及1∶625稀釋，腹腔注射昆明鼠，每稀釋度6 只，1 周后再次免疫，14 d 后用約20LD50的CVS 進行腦內(nèi)攻擊，每只0.03 mL，攻擊后每日觀察，統(tǒng)計第5～14 d 死亡的小鼠，根據(jù)參比品計算待測樣品效價。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用Spss18.0 統(tǒng)計學軟件，采用線性相關(guān)分析及配對t檢驗方法。

2 結(jié)果

對8 批疫苗生產(chǎn)中連續(xù)生產(chǎn)的中間品進行MABT 及NIH 測定效價，結(jié)果見表1；2 種方法測定結(jié)果呈正相關(guān)（R2=0.8749），見圖1；配對t檢驗表明二者無顯著統(tǒng)計學差異（P=0.997）。

3 討論

疫苗效價反映了注射疫苗后產(chǎn)生的抗體水平，是狂犬病疫苗生產(chǎn)中一項關(guān)鍵技術(shù)指標。NIH 法是狂犬病疫苗效價檢測的標準方法，但該方法周期長，結(jié)果受多種因素影響，重復(fù)性較差。通過將抗體結(jié)合試驗與RFFIT 結(jié)合，我們建立了一種檢測aG 株狂犬病疫苗的方法。試驗結(jié)果表明，M-ABT 與NIH 法效價檢測結(jié)果呈正相關(guān)，二者沒有顯著統(tǒng)計學差異，這與其他文獻報道結(jié)果一致[3-5]。M-ABT 是一種體外測定狂犬病疫苗效價的試驗方法，與NIH 法相比，具有如下優(yōu)點：①耗時短，2 d 內(nèi)即可得到結(jié)果，而NIH 法需要28 d；②無需實驗動物，成本低，也符合WHO 提倡的動物試驗3R 原則；③重復(fù)性好，結(jié)果在不同實驗室之間具有一致性[6]；④操作簡單，通量高，可以大大減少工作量。

表1 M-ABT法和NIH法測定狂犬病毒疫苗效價

圖1 NIH效價與改良抗體結(jié)合試驗效價相關(guān)關(guān)系

除抗體結(jié)合試驗外，試驗室替代NIH 法測定狂犬疫苗效價的方法還有競爭ELISA 法[7-8]、火箭電泳法[9]、單向輻射免疫擴散試驗、抗體結(jié)合試驗等，但目前NIH 法仍是檢測狂犬病疫苗效價的金標準。在疫苗生產(chǎn)過程中應(yīng)用M-ABT 有利于加強狂犬病疫苗質(zhì)量控制，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率。

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