王大煒，程韻，王婷婷，陳曉萍

浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032

2013 年5 月，Deisseroth[1]等在《Nature》上報(bào)道了一種名為“CLARITY”的全新腦組織形態(tài)分析技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建三維多孔水凝膠網(wǎng)絡(luò)和選擇性洗脫膜脂分子，得到了一種通澈透明的腦結(jié)構(gòu)模型，這種新型模型能在完整腦原位呈現(xiàn)立體的神經(jīng)突觸與神經(jīng)纖維投射網(wǎng)絡(luò)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)/核酸/神經(jīng)遞質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，在腦結(jié)構(gòu)與功能研究中具有重要應(yīng)用前景，因而被認(rèn)為是2013年全球重要的科技進(jìn)展[2]。

CLARITY 技術(shù)明顯改善和突破了傳統(tǒng)組織形態(tài)學(xué)研究技術(shù)的局限與不足。在傳統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)研究技術(shù)中，細(xì)胞表面與內(nèi)部的膜脂以及細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)組成折光屏障，阻擋光線穿透組織細(xì)胞，因而不能形成直觀透視圖像，需要將組織進(jìn)行切片，逐片分析其形態(tài)結(jié)構(gòu)[3-8]。近年來(lái)，一些科學(xué)家通過(guò)對(duì)組織制片過(guò)程中預(yù)處理方法的改進(jìn)，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了部分組織結(jié)構(gòu)的立體成像，如大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的3D成像，但并未從根本上解決問(wèn)題[9-11]。CLARITY 技術(shù)則是采用丙烯酰胺單體在腦組織內(nèi)聚合形成水凝膠，利用聚丙烯酰胺水凝膠的生物特性，結(jié)合和固定組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)與核酸，選擇性洗脫阻擋光線通透的脂分子，從而呈現(xiàn)出保持了原有組織細(xì)胞形態(tài)的三維立體通透圖像[1,12]。

CLARITY 技術(shù)中對(duì)脂分子的選擇性洗脫在電泳條件下進(jìn)行，在Deisseroth 的方法中，作者自制了專(zhuān)用的腦組織電泳裝置（electrophoretic tissue clearing，ETC），以高濃度的十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液作為電泳緩沖液和洗脫溶液?？紤]到在國(guó)內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)技術(shù)的設(shè)備局限性，我們根據(jù)CLARITY 技術(shù)原理，利用普通生物實(shí)驗(yàn)室常用的電泳裝置，對(duì)操作流程稍做改變，在自己實(shí)驗(yàn)室初步建立了這項(xiàng)技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料

20周齡雌性ICR小鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重35～40 g，飼養(yǎng)室溫度（20±2）℃，濕度50%～60%，12 h/12 h晝夜光周期，自由攝食和飲水。

丙烯酰胺（99.9%）、雙丙烯酰胺（99%）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；VA044 引發(fā)劑（98.0%）購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；多聚甲醛（95%）購(gòu)自Sigma 公司；SDS（化學(xué)純）購(gòu)自上海英鵬化學(xué)試劑有限公司；硼酸（分析純）購(gòu)自太倉(cāng)美達(dá)試劑有限公司；細(xì)胞過(guò)濾器（40μm 孔徑）購(gòu)自上海臥宏生物科技有限公司；DYY-8C 型電泳儀、DYCP-31A型電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠。

水凝膠預(yù)反應(yīng)液：4%多聚甲醛，4%丙烯酰胺，0.05%雙叉丙烯酰胺，0.25% VA044 引發(fā)劑，溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，新鮮配制，預(yù)冷至4℃。

電泳/洗滌緩沖液：4% SDS 溶于200 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH8.5），室溫保存，使用前預(yù)溫至50℃。

1.2 腦室灌注

小鼠皮下注射40 mg/kg 戊巴比妥鈉溶液，待其完全麻醉后，將小鼠平躺置于冰上，在胸腹部剪開(kāi)暴露心臟，用7 號(hào)輸液針頭插入左心室，同時(shí)在右心耳剪開(kāi)小口作為液體流出口。先緩緩灌注50 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液，再灌注預(yù)冷的水凝膠預(yù)反應(yīng)液30 mL，迅速剝離完整腦組織，用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗后置于盛有水凝膠預(yù)反應(yīng)液的小燒杯中，保鮮膜封口，于4℃冰箱內(nèi)放置3 d，使水凝膠預(yù)反應(yīng)液慢慢滲入鼠腦。

1.3 水凝膠包埋

將4℃反應(yīng)3 d 的小燒杯取出，于40℃水浴中孵育3 h，待聚合反應(yīng)結(jié)束，取出燒杯，自然冷卻至室溫，從水凝膠塊中剝出完整鼠腦，于50℃電泳/洗滌緩沖液中浸泡24 h，12 h 換液一次，以去除鼠腦內(nèi)殘留的多聚甲醛和引發(fā)劑等物質(zhì)。

1.4 透明化

將浸泡于電泳/洗滌緩沖液的鼠腦移至細(xì)胞過(guò)濾器，固定于電泳槽的負(fù)極凹槽內(nèi)，加入足量緩沖液，在水溫50℃、電壓40 V、電流150 mA 條件下電泳洗滌，每天更換50%緩沖液，每隔2 d觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 腦組織的水凝膠包埋

如圖1 所示，多聚甲醛固定、水凝膠包埋后的腦組織呈乳白色不透明狀，質(zhì)地柔軟富有彈性，周?chē)乃z透明無(wú)色。腦組織與周?chē)木郾０纺z相互交融成為一體，刀片切割后成為水凝膠塊。

2.2 腦組織的透明化進(jìn)程

在SDS 電泳洗滌條件下，腦組織中的脂類(lèi)物質(zhì)被逐步置換去除，腦組織也逐漸變得透明。如圖2所示，在洗滌開(kāi)始前，腦組織呈現(xiàn)均勻不透明的乳白色；2 d 后，周邊部的乳白色顏色開(kāi)始減退，但中心部分無(wú)明顯變化；4 d 時(shí)，周邊部分開(kāi)始呈現(xiàn)半透明，而中心部分仍為乳白色不透明狀；6 d 時(shí)，周邊半透明區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，而中心乳白色不透明區(qū)域進(jìn)一步縮??；8 d 時(shí)，中心乳白色不透明區(qū)域已基本消除，整個(gè)腦組織呈現(xiàn)為半透明狀態(tài)，周邊區(qū)域透明程度增加；10 d 時(shí)，周邊透明區(qū)域擴(kuò)大，中心半透明區(qū)域逐漸縮小。在整個(gè)透明化過(guò)程中，由于水凝膠吸水溶脹的作用，腦組織出現(xiàn)了一定程度的膨脹。

3 討論

CLARITY 技術(shù)的基本流程包括多聚甲醛組織固定、聚丙烯酰胺凝膠包埋、電泳洗滌等3 個(gè)步驟。與常規(guī)組織形態(tài)學(xué)研究技術(shù)不同，CLARITY 技術(shù)將腦組織包埋于無(wú)色透明的聚丙烯酰胺中，這種納米級(jí)別的立體網(wǎng)絡(luò)既能物理性支撐柔軟的腦組織，同時(shí)還能原位結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸等大分子[13-15]。在洗滌階段，高濃度的SDS 構(gòu)成脂-水交融環(huán)境，分散膜脂分子成為帶負(fù)電荷顆粒，在電場(chǎng)作用下被逐步從腦組織中交換去除，而蛋白質(zhì)、核酸因結(jié)合于水凝膠網(wǎng)絡(luò)保留在原位[16-17]。因此，CLARITY 最主要的特點(diǎn)在于：①運(yùn)用水凝膠網(wǎng)絡(luò)選擇性去除脂類(lèi)；②ETC 裝置提供強(qiáng)電場(chǎng)洗滌環(huán)境。

圖1 水凝膠包埋后的腦組織

圖2 鼠腦的透明化過(guò)程

圖3 CLARITY技術(shù)的基本步驟

Deisseroth 的實(shí)驗(yàn)采用了自制電泳裝置，它電泳間距短，電場(chǎng)力強(qiáng)，并帶有電泳/洗滌液持續(xù)流動(dòng)交換裝置。由于該設(shè)備自行制備有一定技術(shù)要求，我們想到了利用實(shí)驗(yàn)室中的普通平板電泳裝置，在對(duì)有關(guān)技術(shù)參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整后，開(kāi)展本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

我們首先對(duì)新鮮腦組織進(jìn)行了水凝膠包埋，通過(guò)腦室灌注水凝膠預(yù)反應(yīng)液和低溫緩慢聚合反應(yīng)，丙烯酰胺、雙叉丙烯酰胺、引發(fā)劑等凝膠前體物質(zhì)逐漸滲入腦組織，在腦中逐漸聚合成富有彈性的水凝膠結(jié)構(gòu)。由于腦組織中脂類(lèi)物質(zhì)具有強(qiáng)的可見(jiàn)光折光能力，組織塊呈現(xiàn)白色不透明狀態(tài)。在接下來(lái)的電泳洗脫中，膜脂分子被SDS分散，形成帶有負(fù)電荷的顆粒，在電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)而被逐漸去除，腦組織也逐漸變得透明。

與Deisseroth 的實(shí)驗(yàn)相比，我們用常規(guī)電泳儀代替ETC裝置，電場(chǎng)力較弱，電泳洗滌液的更換也只能定時(shí)進(jìn)行而不是持續(xù)交換，因而電泳洗滌效果略差，需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能完成透明化過(guò)程。CLARITY作為新興技術(shù)，目前還存在組織塊膨脹、實(shí)驗(yàn)周期太長(zhǎng)等一系列問(wèn)題[1,12]，我們正在繼續(xù)探討，進(jìn)一步優(yōu)化技術(shù)條件。

腦科學(xué)研究目前面臨重要的發(fā)展機(jī)遇。2013年4 月，美國(guó)政府啟動(dòng)腦科學(xué)研究計(jì)劃（Brain Activity Map Project），歐盟近期也有類(lèi)似計(jì)劃。以腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為核心的腦結(jié)構(gòu)與功能研究正在快速發(fā)展，成為新興熱點(diǎn)領(lǐng)域[18-20]。作為能夠直觀立體顯示神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的新型形態(tài)學(xué)研究技術(shù)，CLARITY 在腦結(jié)構(gòu)、功能、神經(jīng)精神疾病病理機(jī)制研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。我們的研究基于普通實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件，有助于CLARITY技術(shù)的推廣。

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