張琴，廖揚(yáng)，石玉玲

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科；b.檢驗(yàn)科；廣東 廣州 510010

血細(xì)胞分析儀現(xiàn)已是各實(shí)驗(yàn)室較為普遍的儀器,血小板（platelet，PLT）計(jì)數(shù)檢測是臨床血細(xì)胞計(jì)數(shù)檢驗(yàn)中一項(xiàng)重要的分析指標(biāo)。然而，血小板由于體積小，尤其是極易發(fā)生黏附、聚集和變性破壞反應(yīng)，給計(jì)數(shù)帶來了麻煩。我們采用Sysmex XN-3000血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)血小板的電阻抗法（PLT-I）、光學(xué)法（PLT-O）和熒光色素染色法（PLT-F）進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，以流式細(xì)胞儀為參考標(biāo)準(zhǔn)，從多個(gè)方面評價(jià)3種方法計(jì)數(shù)血小板的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集本院2013年6～10月住院、門診患者清晨空腹的血常規(guī)標(biāo)本，用EDTA-K2抗凝。其中血小板＜50×109/L 為低值組，（50×109～125×109）/L 為低中值組，（126×109～350××109）/L為中值組，＞350××109/L為高值組。

1.2 儀器與試劑

Sysmex XN-3000 全自動血細(xì)胞分析儀及配套試劑；BD FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀及配套試劑；藻紅蛋白標(biāo)記的抗CD61單克隆抗體（CD61-PE）。

1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取低值、低中值、中值和高值4 個(gè)水平組各1 份標(biāo)本，進(jìn)行10 次連續(xù)檢測，計(jì)算PLT-I、PLT-O和PLT-F的變異系數(shù)（CV）。

1.4 線性實(shí)驗(yàn)

取高值標(biāo)本（PLT＞600×109/L）1份，分別以原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 稀釋度，用PLT-I、PLT-O和PLT-F方法各做4次測試，取均值與稀釋度理論值做直線回歸分析，以稀釋度理論值為x值，測試值為y值。

1.5 攜帶污染實(shí)驗(yàn)

取1 份高值標(biāo)本（PLT＞600×109/L）連續(xù)3 次計(jì)數(shù)（記為H1、H2、H3），隨機(jī)取1 份低值標(biāo)本（PLT＜20×109/L）連續(xù)3 次計(jì)數(shù)（記為L1、L2、L3），以（L1-L3）/（H3-L1）×100%分別計(jì)算PLT-I、PLT-O和PLT-F 方法的攜帶污染率（n=7）。

1.6 紅細(xì)胞碎片干擾實(shí)驗(yàn)

取1 份血小板計(jì)數(shù)正常的標(biāo)本分裝4 管，每管400μL，將第1管3600 r/min離心5 min后取壓積紅細(xì)胞層100μL，加入蒸餾水振蕩搖勻后3600 r/min離心5 min，留取紅細(xì)胞碎片層用稀釋液反復(fù)洗3次后稀釋至100μL，取40μL加入第2管中，作為高碎片濃度干擾組，再將剩下的紅細(xì)胞碎片懸液60μL加稀釋液至1 mL，取40μL 加入第3 管中，作為低碎片濃度干擾組。第4 管加40μL 稀釋液作為陰性對照。用PLT-I、PLT-O和PLT-F 方法對上述第2、3、4 管進(jìn)行檢測，以第2、3 管PLT 測定值與第4 管測定值進(jìn)行配對t檢驗(yàn)（n=10）。

1.7 方法對比試驗(yàn)

取標(biāo)本在BD FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀上進(jìn)行PLT計(jì)數(shù)，并與Sysmex XN-3000的PLT-I、PLT-O和PLT-F方法計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較（n=28）。以流式細(xì)胞儀得到的PLT＜50×109/L 的標(biāo)本為對象，與上述3種方法進(jìn)行比較（n=13）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

測定數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

PLT-I、PLT-O、PLT-F 方法的CV 分別為1.1%～24.3%、2.1%～11.0%和0.0～3.5%。XN-3000 對PLT精密度設(shè)置要求為CV≤4.0%。見表1。

2.2 線性實(shí)驗(yàn)

PLT-I、PLT-O和PLT-F 等3 種方法的線性理論值與實(shí)測值具有良好的相關(guān)性，見圖1。

2.3 攜帶污染實(shí)驗(yàn)

PLT-I、PLT-O和PLT-F 等3 種方法的平均攜帶污染率分別為0.25%、0.26%、0.09%，均符合XN-3000攜帶污染率PLT設(shè)置要求（≤1.0%）。見表2。

2.4 紅細(xì)胞碎片干擾實(shí)驗(yàn)

以PLT-I、PLT-O和PLT-I 檢測的高濃度組、低濃度組分別與自身對照組做配對t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，在高濃度紅細(xì)胞碎片干擾的情況下，PLT-I、PLT-O測定值與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在低濃度紅細(xì)胞碎片干擾的情況下，PLT-I測定值與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PLT-O 測定值與對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；無論是在高濃度還是低濃度紅細(xì)胞碎片干擾下，PLT-F 法測定值與對照組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05）。見表3。

表1 3種PLT檢測方法的重復(fù)性

表2 3種PLT檢測方法的攜帶污染率（%）

圖1 3種血小板計(jì)數(shù)方法的線性理論值與實(shí)測值的相關(guān)性

2.5 方法對比試驗(yàn)

PLT-I、PLT-O、PLT-F 檢測方法與流式細(xì)胞儀檢測的相關(guān)系數(shù)r分別為0.995、0.997和0.997（圖2），其中PLT＜50×109/L 的低值標(biāo)本的相關(guān)系數(shù)r依次為0.917、0.920和0.929（圖3）。

3 討論

血小板由骨髓中成熟的巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生，具有黏附、聚集、分泌三大功能，在生理性止血及纖溶系統(tǒng)中起重要的作用，因而血小板計(jì)數(shù)對出血性疾病、放療、化療患者的療效監(jiān)測具有重要意義，也是血液系統(tǒng)疾病診斷的一個(gè)重要指標(biāo)。但因其體積小、無色、易黏附，及易受小紅細(xì)胞、紅細(xì)胞碎片、血小板聚集和免疫復(fù)合物等干擾，計(jì)數(shù)往往不能精確反映實(shí)際數(shù)量。因此，外周血中血小板的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)一直是臨床上的難題之一。

表3 紅細(xì)胞碎片對3種PLT檢測方法的干擾效果

世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的血小板計(jì)數(shù)方法，是以10 g/L 的草酸銨溶液作為溶血稀釋液，在相差顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板肉眼計(jì)數(shù)[1-2]。該方法容易受到充池、血小板在計(jì)數(shù)板上的分布、技師的主觀判斷等誤差因素影響，重復(fù)性較差且費(fèi)時(shí)，已不適用于臨床工作的需求[3]。血小板計(jì)數(shù)的參考方法是國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICSH）推薦的使用抗CD61 抗體和抗CD41抗體的流式細(xì)胞術(shù)[4-5]。該法簡便迅速，敏感性和特異性高，尤其適用于低值血小板標(biāo)本的測定，但須使用專用抗體，成本較高，不適合臨床常規(guī)標(biāo)本測定。

現(xiàn)今的全自動化血液分析儀一般PLT-I和PLT-O 法計(jì)數(shù)血小板。PLT-I 是根據(jù)血細(xì)胞相對非導(dǎo)電的性質(zhì)，懸浮在電解質(zhì)溶液中的血細(xì)胞顆粒在通過計(jì)數(shù)小孔時(shí)引起電阻的變化，以此為基礎(chǔ)對血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。PLT-O采用半導(dǎo)體流式細(xì)胞檢測原理，對每個(gè)血小板從高低角度進(jìn)行二維激光掃描，即用前向散射光檢測血小板體積，由熒光強(qiáng)度提供核酸信息進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)的確認(rèn)和計(jì)數(shù)。Sysmex XN-3000 全自動血液分析儀使用的PLT-F 是利用能給血小板染色的熒光色素給血小板染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測前向散射光和側(cè)向散射光，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制出二維散點(diǎn)圖進(jìn)行計(jì)數(shù)。

圖2 3種血小板計(jì)數(shù)方法與流式細(xì)胞儀方法的相關(guān)性（n=28）

圖3 低值標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)與流式細(xì)胞儀方法的相關(guān)性（n=13）

我們參照ICSH、美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會和中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會制定的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6-8]，對Sysmex XN-3000 全自動血液分析儀的PLT-I、PLTO和PLT-F 等3 種測試方法進(jìn)行了性能評價(jià)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，PLT-I、PLT-O和PLT-F 在中值組和高值組的CV 均低于4.0%；而PLT-I和PLT-O 在低值組和低中值組的CV＞4.0%，PLT-F 的CV＜2.0%；并且PLT-F 在各組血小板濃度計(jì)數(shù)的CV 均比其他2 種方法低?？梢?，PLT-F 的精確度較高，PLT-I和PLTO 的精確度較差，尤其在低血小板計(jì)數(shù)時(shí)。線性實(shí)驗(yàn)中，PLT-I、PLT-O和PLT-F 的相關(guān)系數(shù)分別為0.999、1.000、0.999，3 種方法線性理論值與實(shí)測值具有良好的相關(guān)性。攜帶污染實(shí)驗(yàn)中，PLT-F 的平均攜帶污染率最小，PLT-O 的最大，PLT-I 介于兩者之間，但均≤1%，符合PLT攜帶污染率設(shè)置要求。紅細(xì)胞碎片干擾實(shí)驗(yàn)中，PLT-I 的抗干擾能力一般，輕度溶血時(shí)即可影響其血小板的測定；PLT-O 檢測血小板的能力優(yōu)于PLT-I，輕度溶血時(shí)不影響，但重度溶血時(shí)其檢測血小板的結(jié)果不可信[9-10]；PLT-F 具有較強(qiáng)的抗干擾能力，不易受標(biāo)本溶血的影響。另外，與使用抗CD61 抗體的流式細(xì)胞術(shù)比較，PLT-I、PLTO、PLT-F 方法均具有良好的相關(guān)性；在低值血小板中，PLT-I、PLT-O和PLT-F 的相關(guān) 系數(shù)分別為0.917、0.920和0.929，PLT-F 與流式細(xì)胞術(shù)的相關(guān)性良好，準(zhǔn)確性較高。所以，對于PLT 減少的患者，如再生障礙性貧血、急性白血病、原發(fā)性血小板減少性紫癜、彌散性血管內(nèi)溶血等情況下，用PLT-F法進(jìn)行檢測可得到更可靠的結(jié)果。

綜上所述，臨床工作中，常規(guī)標(biāo)本可以使用Sysmex XN-3000全自動血液分析儀的PLT-I和PLT-O法，當(dāng)血小板計(jì)數(shù)、形態(tài)異常或溶血時(shí)，建議使用PLT-F 通道復(fù)查，必要時(shí)用鏡檢法或流式細(xì)胞術(shù)復(fù)查和確認(rèn)，這樣在節(jié)約試劑成本的同時(shí)保證血小板計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，更有利于指導(dǎo)臨床，為臨床提供更可靠的信息。

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