張琴,廖揚,石玉玲
廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院a.醫(yī)學實驗科;b.檢驗科;廣東 廣州 510010
血細胞分析儀現(xiàn)已是各實驗室較為普遍的儀器,血小板(platelet,PLT)計數(shù)檢測是臨床血細胞計數(shù)檢驗中一項重要的分析指標。然而,血小板由于體積小,尤其是極易發(fā)生黏附、聚集和變性破壞反應,給計數(shù)帶來了麻煩。我們采用Sysmex XN-3000血細胞分析儀計數(shù)血小板的電阻抗法(PLT-I)、光學法(PLT-O)和熒光色素染色法(PLT-F)進行血小板計數(shù),以流式細胞儀為參考標準,從多個方面評價3種方法計數(shù)血小板的臨床應用價值。
收集本院2013年6~10月住院、門診患者清晨空腹的血常規(guī)標本,用EDTA-K2抗凝。其中血小板<50×109/L 為低值組,(50×109~125×109)/L 為低中值組,(126×109~350××109)/L為中值組,>350××109/L為高值組。
Sysmex XN-3000 全自動血細胞分析儀及配套試劑;BD FACSCantoⅡ型流式細胞儀及配套試劑;藻紅蛋白標記的抗CD61單克隆抗體(CD61-PE)。
取低值、低中值、中值和高值4 個水平組各1 份標本,進行10 次連續(xù)檢測,計算PLT-I、PLT-O和PLT-F的變異系數(shù)(CV)。
取高值標本(PLT>600×109/L)1份,分別以原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 稀釋度,用PLT-I、PLT-O和PLT-F方法各做4次測試,取均值與稀釋度理論值做直線回歸分析,以稀釋度理論值為x值,測試值為y值。
取1 份高值標本(PLT>600×109/L)連續(xù)3 次計數(shù)(記為H1、H2、H3),隨機取1 份低值標本(PLT<20×109/L)連續(xù)3 次計數(shù)(記為L1、L2、L3),以(L1-L3)/(H3-L1)×100%分別計算PLT-I、PLT-O和PLT-F 方法的攜帶污染率(n=7)。
取1 份血小板計數(shù)正常的標本分裝4 管,每管400μL,將第1管3600 r/min離心5 min后取壓積紅細胞層100μL,加入蒸餾水振蕩搖勻后3600 r/min離心5 min,留取紅細胞碎片層用稀釋液反復洗3次后稀釋至100μL,取40μL加入第2管中,作為高碎片濃度干擾組,再將剩下的紅細胞碎片懸液60μL加稀釋液至1 mL,取40μL 加入第3 管中,作為低碎片濃度干擾組。第4 管加40μL 稀釋液作為陰性對照。用PLT-I、PLT-O和PLT-F 方法對上述第2、3、4 管進行檢測,以第2、3 管PLT 測定值與第4 管測定值進行配對t檢驗(n=10)。
取標本在BD FACSCantoⅡ型流式細胞儀上進行PLT計數(shù),并與Sysmex XN-3000的PLT-I、PLT-O和PLT-F方法計數(shù)結(jié)果進行比較(n=28)。以流式細胞儀得到的PLT<50×109/L 的標本為對象,與上述3種方法進行比較(n=13)。
測定數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進行統(tǒng)計學分析。
PLT-I、PLT-O、PLT-F 方法的CV 分別為1.1%~24.3%、2.1%~11.0%和0.0~3.5%。XN-3000 對PLT精密度設置要求為CV≤4.0%。見表1。
PLT-I、PLT-O和PLT-F 等3 種方法的線性理論值與實測值具有良好的相關(guān)性,見圖1。
PLT-I、PLT-O和PLT-F 等3 種方法的平均攜帶污染率分別為0.25%、0.26%、0.09%,均符合XN-3000攜帶污染率PLT設置要求(≤1.0%)。見表2。
以PLT-I、PLT-O和PLT-I 檢測的高濃度組、低濃度組分別與自身對照組做配對t檢驗。結(jié)果表明,在高濃度紅細胞碎片干擾的情況下,PLT-I、PLT-O測定值與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在低濃度紅細胞碎片干擾的情況下,PLT-I測定值與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而PLT-O 測定值與對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);無論是在高濃度還是低濃度紅細胞碎片干擾下,PLT-F 法測定值與對照組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。見表3。
表1 3種PLT檢測方法的重復性
表2 3種PLT檢測方法的攜帶污染率(%)
圖1 3種血小板計數(shù)方法的線性理論值與實測值的相關(guān)性
PLT-I、PLT-O、PLT-F 檢測方法與流式細胞儀檢測的相關(guān)系數(shù)r分別為0.995、0.997和0.997(圖2),其中PLT<50×109/L 的低值標本的相關(guān)系數(shù)r依次為0.917、0.920和0.929(圖3)。
血小板由骨髓中成熟的巨核細胞分化產(chǎn)生,具有黏附、聚集、分泌三大功能,在生理性止血及纖溶系統(tǒng)中起重要的作用,因而血小板計數(shù)對出血性疾病、放療、化療患者的療效監(jiān)測具有重要意義,也是血液系統(tǒng)疾病診斷的一個重要指標。但因其體積小、無色、易黏附,及易受小紅細胞、紅細胞碎片、血小板聚集和免疫復合物等干擾,計數(shù)往往不能精確反映實際數(shù)量。因此,外周血中血小板的準確計數(shù)一直是臨床上的難題之一。
表3 紅細胞碎片對3種PLT檢測方法的干擾效果
世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的血小板計數(shù)方法,是以10 g/L 的草酸銨溶液作為溶血稀釋液,在相差顯微鏡下用血細胞計數(shù)板肉眼計數(shù)[1-2]。該方法容易受到充池、血小板在計數(shù)板上的分布、技師的主觀判斷等誤差因素影響,重復性較差且費時,已不適用于臨床工作的需求[3]。血小板計數(shù)的參考方法是國際血液學標準委員會(ICSH)推薦的使用抗CD61 抗體和抗CD41抗體的流式細胞術(shù)[4-5]。該法簡便迅速,敏感性和特異性高,尤其適用于低值血小板標本的測定,但須使用專用抗體,成本較高,不適合臨床常規(guī)標本測定。
現(xiàn)今的全自動化血液分析儀一般PLT-I和PLT-O 法計數(shù)血小板。PLT-I 是根據(jù)血細胞相對非導電的性質(zhì),懸浮在電解質(zhì)溶液中的血細胞顆粒在通過計數(shù)小孔時引起電阻的變化,以此為基礎對血細胞進行計數(shù)。PLT-O采用半導體流式細胞檢測原理,對每個血小板從高低角度進行二維激光掃描,即用前向散射光檢測血小板體積,由熒光強度提供核酸信息進行內(nèi)部結(jié)構(gòu)的確認和計數(shù)。Sysmex XN-3000 全自動血液分析儀使用的PLT-F 是利用能給血小板染色的熒光色素給血小板染色,采用流式細胞術(shù)檢測前向散射光和側(cè)向散射光,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制出二維散點圖進行計數(shù)。
圖2 3種血小板計數(shù)方法與流式細胞儀方法的相關(guān)性(n=28)
圖3 低值標本血小板計數(shù)與流式細胞儀方法的相關(guān)性(n=13)
我們參照ICSH、美國臨床和實驗室標準協(xié)會和中國實驗室國家認可委員會制定的評價標準[6-8],對Sysmex XN-3000 全自動血液分析儀的PLT-I、PLTO和PLT-F 等3 種測試方法進行了性能評價。重復性實驗中,PLT-I、PLT-O和PLT-F 在中值組和高值組的CV 均低于4.0%;而PLT-I和PLT-O 在低值組和低中值組的CV>4.0%,PLT-F 的CV<2.0%;并且PLT-F 在各組血小板濃度計數(shù)的CV 均比其他2 種方法低。可見,PLT-F 的精確度較高,PLT-I和PLTO 的精確度較差,尤其在低血小板計數(shù)時。線性實驗中,PLT-I、PLT-O和PLT-F 的相關(guān)系數(shù)分別為0.999、1.000、0.999,3 種方法線性理論值與實測值具有良好的相關(guān)性。攜帶污染實驗中,PLT-F 的平均攜帶污染率最小,PLT-O 的最大,PLT-I 介于兩者之間,但均≤1%,符合PLT攜帶污染率設置要求。紅細胞碎片干擾實驗中,PLT-I 的抗干擾能力一般,輕度溶血時即可影響其血小板的測定;PLT-O 檢測血小板的能力優(yōu)于PLT-I,輕度溶血時不影響,但重度溶血時其檢測血小板的結(jié)果不可信[9-10];PLT-F 具有較強的抗干擾能力,不易受標本溶血的影響。另外,與使用抗CD61 抗體的流式細胞術(shù)比較,PLT-I、PLTO、PLT-F 方法均具有良好的相關(guān)性;在低值血小板中,PLT-I、PLT-O和PLT-F 的相關(guān) 系數(shù)分別為0.917、0.920和0.929,PLT-F 與流式細胞術(shù)的相關(guān)性良好,準確性較高。所以,對于PLT 減少的患者,如再生障礙性貧血、急性白血病、原發(fā)性血小板減少性紫癜、彌散性血管內(nèi)溶血等情況下,用PLT-F法進行檢測可得到更可靠的結(jié)果。
綜上所述,臨床工作中,常規(guī)標本可以使用Sysmex XN-3000全自動血液分析儀的PLT-I和PLT-O法,當血小板計數(shù)、形態(tài)異?;蛉苎獣r,建議使用PLT-F 通道復查,必要時用鏡檢法或流式細胞術(shù)復查和確認,這樣在節(jié)約試劑成本的同時保證血小板計數(shù)結(jié)果的可靠性,更有利于指導臨床,為臨床提供更可靠的信息。
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