王天藝，張彥，師明磊，趙志虎

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

CCCTC 結(jié)合因 子（CCCTC binding factor，CTCF，又稱11-鋅指蛋白）是一種進(jìn)化上高度保守、廣泛表達(dá)的多功能鋅指蛋白，其與靶順式元件的結(jié)合可阻斷增強(qiáng)子和啟動子的相互作用，是脊椎動物中惟一的絕緣子調(diào)節(jié)蛋白[1-2]。CTCF 參與很多細(xì)胞生物學(xué)過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、絕緣活性、V（D）J重組、RNA 剪接和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控[1-3]等。CTCF 作為一個廣泛表達(dá)的絕緣子調(diào)節(jié)蛋白，對基因表達(dá)和遠(yuǎn)距離的染色質(zhì)相互作用具有重要作用[3-5]。通過11 個鋅指的不同組合，CTCF識別眾多不同的靶標(biāo)。通過自身的多聚化、多種翻譯后修飾，或者與Cohesin、Suz2、YY1 等不同蛋白互作，介導(dǎo)廣泛的染色質(zhì)相互作用，作為基因組高級結(jié)構(gòu)的主要組織者發(fā)揮眾多不同的功能[6-7]。其異常與前列腺癌、乳腺癌、Wilmington腫瘤等的發(fā)生密切相關(guān)[8]。據(jù)報道，CTCF能與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)基因Rb2/p130 啟動子區(qū)結(jié)合，形成特定的構(gòu)象以維持其轉(zhuǎn)錄活性，而加速肺癌的進(jìn)展或有利于腫瘤的復(fù)發(fā)[9]。另外發(fā)現(xiàn)在幾種肺癌細(xì)胞中，CTCF敲低后能引起端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位（TERT）的表達(dá)水平也降低，通過依賴于CTCF的增強(qiáng)子-啟動子相互作用環(huán)，CTCF對于維持TERT表達(dá)起到重要作用，因而有利于細(xì)胞永生化和致癌作用[10]。但關(guān)于CTCF 在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能和其發(fā)揮功能的分子機(jī)制仍然了解不清。

RNA 干擾技術(shù)已被廣泛用于基因結(jié)構(gòu)功能和表達(dá)調(diào)控研究，構(gòu)建RNA 干擾載體的方法很多，其中腺病毒是一種較為常見且廣泛使用的方法[11]。本研究中，我們構(gòu)建了腺病毒干擾載體敲低CTCF，為肺癌相關(guān)發(fā)病機(jī)制和治療的研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎上皮細(xì)胞HEK293 細(xì)胞（ID：CRL-1573）和人肺腺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞（ID：CCL-185）來自ATCC；人胚腎上皮細(xì)胞293A 細(xì)胞由本室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物公司；質(zhì)粒pSUPERIOR.retro.puro和pAdTrack-CMV 由本室保存；培養(yǎng)基MEM/EBSS、DMEM/High Glucose和DMEM/F-12 1∶1 購自HyClone 公司；OPTI-MEM 購自Gibco公司；LipofectAMIN E2000試劑購自Invitrogen 公司；膠回收、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根生物公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購自北京壹諾金生物科技有限公司；熒光定量檢測試劑購自南京盛譜基因科技有限公司；兔抗CTCF抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；抗GAPDH兔多克隆抗體和山羊抗兔IgG購自康為試劑公司。

1.2 CTCF小干擾RNA（siRNA）序列設(shè)計

CTCF 短發(fā)夾RNA（shRNA）1 的上游序列為GC AGAGAAAGTGGTTGGTAAT，下游序列為ATTACC AACCACTTTCTCTGC；CTCF shRNA2 的上游序列為GCGCTCTAAGAAAGAAGATTCCTCT，下游序列為AGAGGAATCTTCTTTCTTAGAGCGC。RT-qPCR 的CTCF 上游引物為5'-ATGTGCGATTACGCCAGTGT A-3'，下游引物為5'-TGAAACGGACGCTCTCCAGT A-3'；GAPDH 上游引物為5'-CATGAGAAGTATGA CAACAGCCT-3'，下游引物為5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'。PCR引物由金維智公司合成。

1.3 CTCF的RNA干擾載體構(gòu)建

從文獻(xiàn)[12]中獲得CTCF 敲低靶序列，經(jīng)Blast 比對正確后合成2 對寡核苷酸序列，退火、磷酸化后分別插入pSUPERIOR.retro.puro 載體，PCR 亞克隆H1啟動子表達(dá)框，酶切連接到pAdTrack-CMV 載體，電轉(zhuǎn)BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞，鑒定重組質(zhì)粒（30 kb），轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收獲腺病毒。

1.4 293A細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒包裝

新復(fù)蘇的293A 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/High Glucose 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液，將細(xì)胞傳至60 mm 培養(yǎng)皿至細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將1μg 質(zhì)粒DNA和3μL LipofectAMINE 2000 分別用無血清、無雙抗的Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5 min，然后將上述2 種液體混勻，室溫放置20 min，加入60 mm 培養(yǎng)皿中，晃動混勻培養(yǎng)液，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)5～7 d后收獲病毒。

HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)同上，培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清的MEM/EBSS培養(yǎng)基。

1.5 Western印跡檢測CTCF的表達(dá)

將人胚腎HEK293 傳代至生長密度為80%～90%，分別接入包裝好的敲低腺病毒和空白對照GFP 病毒，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間用熒光倒置顯微鏡觀察病毒感染比例；2～3 d 后收獲細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，收獲蛋白；BCA定量后取適量蛋白加入SDS上樣緩沖液，煮沸5～10 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE；電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用含5%牛奶的TBST 封閉1 h，加入抗CTCF 多克隆抗體（1∶500 稀釋），4℃孵育過夜；用1×TBST 洗5 次，每次6 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶3000 稀釋），室溫孵育1 h；用1×TBST 洗5 次，每次6 min，加入底物發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。

1.6 RT-PCR檢測CTCF的表達(dá)

分別收集感染細(xì)胞，加入TRIzol 試劑提取總RNA后定量，取1μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照試劑說明合成第一條cDNA鏈，以其為模板，用RT-qPCR儀進(jìn)行實時定量，收集熒光信號并檢測實驗組和對照組中相關(guān)基因的表達(dá)，分析各組擴(kuò)增的Ct 值和相對表達(dá)豐度。

1.7 A549細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒感染和CTCF的檢測

將A549 細(xì)胞復(fù)蘇于含10%胎牛血清的DMEM/F-12 1∶1 培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d 換液，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，將細(xì)胞傳代于六孔板，待細(xì)胞生長密度達(dá)到約80%，分別感染腺病毒和GFP 空白對照病毒，2～3 d 后，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并收集細(xì)胞。

Western 印跡和RT-PCR 檢測CTCF 的表達(dá)方法同上。

2 結(jié)果

2.1 CTCF shRNA腺病毒載體的構(gòu)建

將合成的2 對寡核苷酸序列分別進(jìn)行退火、磷酸化后，連接pSUPERIOR.retro.puro 載體，轉(zhuǎn)化后挑克隆提質(zhì)粒，經(jīng)SmaⅠ酶切應(yīng)產(chǎn)生3 條帶，分別為1000、1750、3600 bp（圖1），電泳顯示完全正確；質(zhì)粒測序結(jié)果表明CTCF shRNA 已插入載體且序列與預(yù)期完全一致（圖2）。PCR亞克隆H1啟動子表達(dá)框后連接到pAdTrack-CMV 載體，電轉(zhuǎn)BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞獲得正確的重組質(zhì)粒（30 kb），此重組質(zhì)粒在293A細(xì)胞中將包裝為表達(dá)CTCF shRNA的腺病毒。

2.2 利用HEK293 細(xì)胞檢測CTCF shRNA 對CTCF的抑制效果

CTCF shRNA 腺病毒包裝完成后，在HEK293細(xì)胞中分別感染CTCF shRNA和空白對照GFP 病毒，2～3 d 后分別收獲細(xì)胞蛋白和提取RNA。蛋白SDS-PAGE 及Western 印跡結(jié)果顯示，與對照GFP 腺病毒組相比，表達(dá)CTCF shRNA 的2 個試驗組蛋白水平都明顯降低（圖3）。對RNA 進(jìn)行RT-qPCR 檢測，發(fā)現(xiàn)CTCF shRNA1、shRNA2 號片段都能較好地抑制CTCF 的轉(zhuǎn)錄水平。說明這2 株表達(dá)CTCF shRNA 的腺病毒在蛋白和mRNA 水平上都具有較好的抑制效果。

圖1 CTCF shRNA片段與pSUPERIOR.retro.puro載體連接后經(jīng)SmaⅠ酶切產(chǎn)物的電泳圖譜

圖2 CTCF shRNA重組質(zhì)粒的測序結(jié)果

2.3 在A549 細(xì)胞中驗證CTCF shRNA 腺病毒對CTCF的蛋白和基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制效果

在含有內(nèi)源性CTCF 的人肺腺癌A549 細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染CTCF shRNA和空白對照GFP 病毒后，收獲蛋白和RNA 進(jìn)行檢測。Western 印跡和RT-PCR結(jié)果表明，與空白對照相比，感染了CTCF shRNA 腺病毒的A549 細(xì)胞中CTCF 的蛋白表達(dá)（圖5）和RNA水平（圖6）都明顯降低，且shRNA1 的效應(yīng)更明顯。說明構(gòu)建的2株CTCF shRNA腺病毒均有效。

3 討論

圖3 Western印跡檢測HEK293細(xì)胞中CTCF shRNA的敲低效果

圖4 RT-qPCR檢測HEK293細(xì)胞中CTCF shRNA的敲低效果

圖5 Western印跡檢測A549細(xì)胞中CTCF shRNA的敲低效果

圖6 RT-qPCR檢測A549細(xì)胞中CTCF shRNA的敲低效果

CTCF 是一種進(jìn)化上高度保守的多功能鋅指蛋白，在不同細(xì)胞中廣泛表達(dá)且結(jié)合位點(diǎn)眾多[13]，并通過調(diào)節(jié)多種靶蛋白和基因的增強(qiáng)或絕緣作用而發(fā)揮重要。據(jù)現(xiàn)有報道，CTCF的異常與多種腫瘤發(fā)生和生理異常緊密相關(guān)。肺癌作為全世界尤其是我國的高發(fā)腫瘤疾病之一，了解其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和關(guān)鍵調(diào)控因子，尋找合適的控制手段和治療靶標(biāo)，對于有效預(yù)防和控制其發(fā)生和惡化尤其重要。在本研究中，我們構(gòu)建了2 個CTCF shRNA 表達(dá)腺病毒載體，其中shRNA1 的效果更為明顯。這將為研究和比較CTCF敲低前后，肺癌中關(guān)鍵調(diào)控因子和蛋白的表達(dá)變化、細(xì)胞內(nèi)染色體構(gòu)象改變及肺癌細(xì)胞的永生和致癌能力變化等提供重要手段，有利于探討肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制并進(jìn)一步尋求控制肺癌進(jìn)展的有效手段。

[1]Phillips J E,Corces V G.CTCF:master weaver of the genome[J].Cell,2009,137(7):1194-1211.

[2]Yusufzai T M,Tagami H,Nakatani Y,et al.CTCF tethers an insulator to subnuclear sites,suggesting shared insulator mechanisms across species[J].Mol Cell,2004,13(2):291-298.

[3]Hou C,Zhao H,Tanimoto K,et al.CTCF-dependent enhancer-blocking by alternative chromatin loop formation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(51):20398-20403.

[4]Shukla S,Kavak E,Gregory M,et al.CTCF-promoted RNA polymerase II pausing links DNA methylation to splicing[J].Nature,2011,479(7371):74-79.

[5]Bell A C,Felsenfeld G.Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene[J].Nature,2000,405(6785):482-485.

[6]Rubio E D,Reiss D J,Welcsh P L,et al.CTCF physically links cohesin to chromatin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(24):8309-8314.

[7]Huang K,Jia J,Wu C,et al.Ribosomal RNA gene transcription mediated by the master genome regulator protein CTCF is negatively regulated by condensin complex[J].J Biol Chem,2013,288(36):26067-26077.

[8]Ohlsson R,Renkawitz R,Lobanenkov V.CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease[J].Trends Genet,2001,17(9):520-527.

[9]Fiorentino F P,Macaluso M,Miranda F,et al.CTCF and BORIS regulate Rb2/p130 gene transcription:a novel mechanism and a new paradigm for understanding the biology of lung cancer[J].Mol Cancer Res,2011,9(2):225-233.

[10]Eldholm V,Haugen A,Zienolddiny S.CTCF mediates the TERT enhancer-promoter interactions in lung cancer cells:identification of a novel enhancer region involved in the regulation of TERT gene[J].Int J Cancer,2014,134(10):2305-2313.

[11]He T C,Zhou S,da Costa L T,et al.A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(5):2509-2514.

[12]Schmidt D,Schwalie P C,Ross-Innes C S,et al.A CTCF-independent role for cohesin in tissue-specific transcription[J].Genome Res,2010,20(5):578-588.

[13]Kim T H,Abdullaev Z K,Smith A D,et al.Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF-binding sites in the human genome[J].Cell,2007,128(6):1231-1245.