任皎，趙莉，張卉，郝明強(qiáng)，周玲，田厚文，譚文杰，阮力

中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

人乳頭瘤病毒（human papillomavirs，HPV）6 型和11 型在該家族中屬于低危型（low risk，LR），90%的肛門-生殖器疣（ano-genital warts，GW），即熟知的尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）由這2型引起[1-2]，歐洲每年都有1.5%～2.5%的患者，美國每年有100～300 萬新發(fā)病例。我國改革開放以來GW 發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)僅次于淋病位居性傳播疾病的第二位。雖然Merk 公司的6/11/16/18VLP 四價(jià)疫苗能很好地預(yù)防HPV6、HPV11 的感染，但并不清楚已存在的感染和病變，此外由于價(jià)格和宗教問題等原因，在一定時(shí)間內(nèi)該疫苗較難在發(fā)展中國家推廣使用。這意味著在相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)仍舊會存在尖銳濕疣病人。目前尖銳濕疣的傳統(tǒng)治療沒有從根本上解決復(fù)發(fā)問題[3]，因?yàn)榛颊呒?xì)胞免疫反應(yīng)受到不同程度的抑制，而細(xì)胞免疫恰恰在疣體清除中起重要作用[4]。近幾年的研究表明，HPV E6 蛋白在清除HPV 相關(guān)病變中起重要作用[5]。因此，我們在前期構(gòu)建的尖銳濕疣治療疫苗HPV11 L2E7融合蛋白的基礎(chǔ)上[6]，將E6 抗原加入，為了提高表達(dá)水平，我們將L2 蛋白N端具有中和活性的120 個(gè)氨基酸殘基保留，其余刪除。新的融合蛋白L2NE7E6 在原核系統(tǒng)中得到表達(dá)，在小鼠體內(nèi)觀察了其誘發(fā)的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，并對E6、E7 的T 細(xì)胞表位進(jìn)行篩選，確定優(yōu)勢表位。本研究可為HPV11 型尖銳濕疣治療性疫苗的篩選評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及候選疫苗株。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6（H-2b）小鼠，6～8周齡，雌性，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所SPF2 級動(dòng)物房飼養(yǎng)；大腸桿菌BL21（DE3+）和DH5α菌株由本室保存；pMD18-T 載體購自TaKaRa 公 司；pET9a 載體購自Invitrogen 公司；pETHPV11L2E7E6 由本室構(gòu)建保存；限制性內(nèi)切酶和T4DNA 連接酶購自Biolab公司；DNA 提取試劑盒購自北京天根公司；小鼠IFN-γ ELISPOT 試劑盒購自BD公司；HPV16 L2多抗由本室制備；CpG-ODN[7]（5'TCCATGACGTTCCTGACGT T3'）和小鼠CpG 寡脫氧核苷酸由上海生工公司合成；CM Sepharosetm FastFlow介質(zhì)購自Amersham Pharmacia公司。

HPV11 E7、E6多肽設(shè)計(jì)按照氨基酸序列，每15個(gè)氨基酸殘基為一條肽段，相鄰肽段重疊11 個(gè)氨基酸殘基。其中E6共35條肽，只合成單號肽段；E7共22條肽段，全部合成，但第15、16、20、21號肽段未能合成。由北京中科亞光生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 L2NE7E6融合基因的構(gòu)建

為將HPV11 L2E7E6 融合基因中的L2 基因C端缺失，僅保留N 段360 bp（編碼120 個(gè)氨基酸），以含HPV11 L2E7E6 融合基因的質(zhì)粒pET9aHPV11L2E7E6 為模板，用引物P1/P2和P3/P4 分別擴(kuò)增L2N120（～360 bp）和E7E6（～747 bp）目的基因片段（擴(kuò)增條件：94℃3 min 預(yù)變性，然后以94℃30 s、56℃30 s、72℃50 s 行30 個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min）。PCR 擴(kuò)增片段L2N120和E7E6 經(jīng)凝膠回收，將2片段混合作為模板，以P1/P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：94℃4 min 預(yù)變性，然后以94℃50 s、65℃ 40 s、72℃ 1 min 行30 個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min），擴(kuò)增出目的片段L2NE7E6（～1107 bp）。將目的片段克隆到pMD18-T 載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定正確后送擎科公司測序確認(rèn)，命名為pMD18T-11L2NE7E6。引物序列見表1。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pETHPV11L2NE7E6的構(gòu)建

質(zhì)粒pMD18T-11L2NE7E6 經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ酶切消化后，用瓊脂糖凝膠電泳回收L2NE7E6 基因片段，與經(jīng)相同酶消化的pET9a載體連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑單斑擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，酶切鑒定后篩選有正確插入的質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，將該質(zhì)粒命名為pETHPV11L2NE7E6。

1.4 HPV11 L2NE7E6融合蛋白的表達(dá)與鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3+），挑單斑在3 mL LB（含卡那霉素）培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)至D600nm值達(dá)0.6～0.8，加入IPTG（終濃度0.8 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)2 h，取適量培養(yǎng)液離心收集菌體，取約30μg細(xì)菌裂解蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后分析。將SDS-PAGE 膠上蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，過夜封閉，以抗HPV16 L2 豚鼠多抗為第一抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的蛋白A/G 為第二抗體，進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的特異性鑒定。

1.5 HPV11 L2NE7E6融合蛋白的純化

將表達(dá)鑒定正確的克隆株菌種按1/100 的比例接種于含卡那霉素（100μg/mL）的200 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm值為0.8，加入IPTG 至終濃度為0.8 mmol/L，25℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集菌體沉淀，用裂解液（50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% Triton，pH8.0）懸起，經(jīng)超聲波裂解后離心收集包涵體，分別用Tris 緩沖液（50 mmol/L Tris，pH8.0）、1 mol/L和2 mol/L 尿素Tris 緩沖液各洗滌一次，再用8 mol/L 尿素（50 mmol/L Tris，pH8.3）懸起，超聲波裂解后離心取上清，用Q 柱純化目的蛋白，最后透析至Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）中，分裝存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR引物及序列

1.6 動(dòng)物免疫方案

設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組每只小鼠左后下肢肌注100μL 20 mmol/L Tris和10μg CpG 的混合液，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠左后下肢肌注50μg L2NE7E6蛋白和10μg CpG 的混合液。免疫程序?yàn)榈? d初免，第14 d加強(qiáng)。

1.7 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測（ELISPOT）

加強(qiáng)免疫后2 周，按照BD 公司小鼠IFN-γ ELISPOT 試劑盒說明書檢測HPV11 E6、E7 肽庫或單肽刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的分泌IFN-γ的效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)，篩選E7、E6蛋白在C57BL/6小鼠的T細(xì)胞表位肽序列。

2 結(jié)果

2.1 HPV11 L2NE7E6融合基因的構(gòu)建

以含有HPV11 E7E6 基因片段的質(zhì)粒pETHPV11L2E7E6 為模板，分別擴(kuò)增出HPV11 L2N和HPV11 E7E6 基因片段，再以重疊PCR 方法擴(kuò)增出約1107 bp 的HPV11 L2NE7E6 融合基因，結(jié)果見圖1。將目的片段插入pMD18-T 載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定正確后送擎科公司測序，測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMD18T-11L2NE7E6 正確插入與設(shè)計(jì)相符的HPV11 L2NE7E6基因。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pETHPV11L2NE7E6的構(gòu)建

將pMD18T-HPV11L2NE7E6 用NdeⅠ、BamHⅠ酶切消化后回收1107 bp 的L2NE7E6 片段，插入pET9a 載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，經(jīng)挑斑酶切鑒定及測序正確后，將重組質(zhì)粒命名為pETHPV11L2NE7E6。

2.3 蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

將質(zhì)粒pETHPV11L2NE7E6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3+），挑取單斑培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDSPAGE 膠分析，在相對分子質(zhì)量約41×103處可見明顯新增表達(dá)帶（圖2A），大小與理論值接近。將誘導(dǎo)表達(dá)菌體的SDS-PAGE 膠上蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，Western 印跡結(jié)果表明該條帶與HPV16 L2 多抗有特異性反應(yīng)，說明新增表達(dá)帶是目的基因表達(dá)蛋白（圖2B）。

誘導(dǎo)表達(dá)菌體用裂解液裂解后，收集包涵體用Tris 緩沖液及尿素洗滌，最后用8 mol/L 尿素懸起超聲波裂解，離心取上清上Q 柱，分別用pH8.3 的100 mmol/L NaCl 洗脫雜蛋白、300 mmol/L NaCl 洗脫目的蛋白，將含有目的蛋白的樣品于4℃透析復(fù)性、濃縮，經(jīng)10% SDS-PAGE 分析蛋白（圖2C），掃描分析蛋白純度約90%。

2.4 重組蛋白L2NE7E6 誘發(fā)的特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)

ELISPOT 檢測HPV11 E7、E6 肽池刺激產(chǎn)生的分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖3、4。從圖3A可看出，對照組PBS和L2NE7E6 重組蛋白組產(chǎn)生針對E6 全合成肽庫的特異性平均斑點(diǎn)數(shù)分別為3和630，說明重組蛋白L2NE7E6能誘發(fā)C57BL/6小鼠產(chǎn)生強(qiáng)的針對HPV11 E6 蛋白的特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。HPV11 E6 肽池ELISPOT 篩選結(jié)果顯示，E6 的11 號肽反應(yīng)最強(qiáng)，位于E6 氨基酸序列的41～55 位，序列為AEIYAYAYKNLKVVW，這與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的HPV11 E6 T細(xì)胞表位44～51正好重疊；C2、R2肽池反應(yīng)次之，根據(jù)圖5A 的矩陣設(shè)計(jì)判斷第13、15、17號肽可能為弱表位肽。圖3B 表明，經(jīng)單肽刺激可篩選出另外2 個(gè)E6 弱表位肽13 號和17 號，分別位于49～63和65～79 位，序列分別為KNLKVVWRDNFPF AA和ACCLELQGKINQYRH。

圖1 HPV11 L2NE7E6融合基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 HPV11 L2NE7E6蛋白的原核表達(dá)和純化的SDS-PAGE（A，C）及Western印跡（B）

E7 肽池ELISPOT 檢測結(jié)果如圖4A，僅有R2和C4 肽池及19 號單肽有弱反應(yīng)，結(jié)合圖5B 的矩陣設(shè)計(jì)分析第11 號肽可能為活性肽段，圖4B 也證明上述分析正確。因此篩選到2 條弱的E7 T 細(xì)胞表位肽，14 號肽位于53～67 殘基，序列為QILTCCCGCDS NVRL，19 號肽位于73～87，序列為DGDIRQLQDLL LGTL。總之，圖4 表明重組蛋白HPV11 L2NE7E6能誘發(fā)C57BL/6 小鼠產(chǎn)生較弱的針對HPV11 E7 蛋白的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。

3 討論

HPV6、HPV11 主要引起尖銳濕疣和復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤病（recurrent respiratory papillomatosis，RRP）。目前GW 的臨床治療方法主要有藥物、損毀性治療、免疫調(diào)節(jié)劑等，治療費(fèi)用高、療程長，復(fù)發(fā)率高。而RRP 的治療也面臨同樣問題，患者需要多次接受疣體切除手術(shù)以保證呼吸道通暢。鑒于目前仍無有效的GW 根治方法，研究治療性疫苗成為能解決復(fù)發(fā)從而根治GW/RRP 的希望。臨床研究表明，尖銳濕疣患者細(xì)胞免疫功能低下，外周血CD4+/CD8+T 細(xì)胞比例下降，Th1/Th2 比值不平衡，而且疾病持續(xù)期愈長細(xì)胞免疫功能愈低下；反之，自然或醫(yī)源性所致疣體消退時(shí)，則出現(xiàn)細(xì)胞免疫功能恢復(fù)或增強(qiáng)[8]。因此，成功的免疫治療應(yīng)該能打破機(jī)體的免疫耐受，并誘發(fā)強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

在本研究中，我們在前期構(gòu)建的HPV11L2E7 融合蛋白[6]中再融入E6 抗原，因?yàn)閷】嫡叩腍PV 感染流行性記憶免疫反應(yīng)（prevalent memory immune response）調(diào)查檢測顯示，HPV 早期蛋白E6 誘發(fā)的免疫反應(yīng)比E7 更常見且更強(qiáng)[4]，因而加入E6 抗原后融合蛋白疫苗在臨床試驗(yàn)中免疫反應(yīng)可能會增強(qiáng)。此外，多個(gè)蛋白抗原的融合能包含更多的病毒細(xì)胞免疫反應(yīng)抗原表位，從而能盡可能減少由于HLA 分子多態(tài)性帶來的無應(yīng)答反應(yīng)。考慮到融合后形成的分子太大，會影響表達(dá)水平，我們將具有前導(dǎo)蛋白作用的L2 蛋白C 端缺失，只保留具有中和抗體表位的N端120 個(gè)氨基酸殘基，以期獲得新融合蛋白的高表達(dá)。但從本研究結(jié)果來看，融合蛋白的表達(dá)水平還待進(jìn)一步提高。后期，我們將通過密碼子優(yōu)化或換用其他原核表達(dá)載體等途徑來提高表達(dá)水平。

圖3 HPV11 E6肽刺激產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)ELISPOT結(jié)果（A）及HPV11 E6多肽表位篩選（B）

圖4 HPV11 E7肽刺激產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)ELISPOT結(jié)果（A）及HPV11 E7多肽表位篩選（B）

圖5 HPV11 E6（A）、E7（B）肽池混合方案

HPV11 L2NE7E6融合蛋白免疫小鼠后，檢測到針對E7、E6 的特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。篩選到的E6 11 號肽表位E6aa41-55 與Peng[9]、Shin[10]發(fā)表的肽段位置一致。在Peng 的研究中未發(fā)現(xiàn)E7 活性表位肽，在Shin 的研究中卻發(fā)現(xiàn)了1 條強(qiáng)的E7 肽段，序列為HCYEQLEDSSEDEVD。但在我們的研究中只發(fā)現(xiàn)了2 條反應(yīng)較弱的E7 肽段，序列分別為KNLKVVWRDNFPFAA、ACCLELQGKINQYRH。這可能與疫苗種類不同有關(guān)，Peng和Shin 均為DNA 疫苗，而我們是重組蛋白疫苗，在抗原的遞呈上DNA疫苗屬內(nèi)源性遞呈，而蛋白疫苗是外源遞呈，可能導(dǎo)致提呈出的表位不同。

由于至今沒有公認(rèn)的評價(jià)尖銳濕疣治療性疫苗效果的動(dòng)物模型，主要通過一些免疫學(xué)指標(biāo)間接反映疫苗效果。后續(xù)我們將在瘤細(xì)胞中導(dǎo)入并表達(dá)HPV11 E6、E7 基因，以此建立腫瘤動(dòng)物模型，評價(jià)HPV11 L2NE7E6疫苗的抑制腫瘤生長作用。

此次工作為HPV11 尖銳濕疣治療疫苗研究建立了初步的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，對于面臨的如何提高細(xì)胞免疫水平問題，可從新型免疫佐劑的使用、免疫程序的改進(jìn)及不同載體疫苗聯(lián)合使用等方面逐步完善。

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