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        水稻病程相關(guān)基因OsPR1b啟動(dòng)子的表達(dá)特性研究

        2014-11-29 04:15:56虞飛博周潔王栩鳴楊勇余初浪程曄嚴(yán)成其陳劍平
        生物技術(shù)通訊 2014年4期
        關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因試劑盒載體

        虞飛博 ,周潔,王栩鳴,楊勇,余初浪,程曄,嚴(yán)成其,陳劍平

        1.浙江師范大學(xué) 生化學(xué)院,浙江 金華 321000;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,農(nóng)業(yè)部植物保護(hù)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省植物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021

        水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的農(nóng)作物之一,為全球半數(shù)以上人口特別是發(fā)展中國(guó)家提供糧食和蛋白質(zhì)的來(lái)源。然而,由于農(nóng)作物單一的種植方式使它的生長(zhǎng)過(guò)程更容易受到外界病原菌的影響,而干旱和鹽漬是影響世界水稻產(chǎn)量的兩個(gè)主要的非生物因素。

        水稻在受病原菌感染、物理傷害和防衛(wèi)相關(guān)信號(hào)等刺激后,會(huì)誘導(dǎo)自身的抗病防衛(wèi)體系,從而激活表達(dá)下游相應(yīng)的病程相關(guān)(pathogenesis-related,PR)基因。PR基因的誘導(dǎo)表達(dá)可以增強(qiáng)植株的抗病性,在水稻病害防御相關(guān)的研究中常被作為特征分子標(biāo)記而廣泛使用[1]。同時(shí),PR基因在衰老、逆境及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。由于PR 蛋白是在植物受到脅迫后誘導(dǎo)合成的一類(lèi)蛋白,它的表達(dá)關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)錄水平[2]。在擬南芥和煙草中,關(guān)于PR基因的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制已有較多報(bào)道[2-5],對(duì)于它們啟動(dòng)子的活性及其順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子的作用也分析得較為詳盡。而水稻作為單子葉植物研究的模式生物,了解PR基因的表達(dá)調(diào)控及功能,對(duì)研究植物的抗病性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        PR1基因是PR基因家族的重要組成部分,它的表達(dá)經(jīng)常被作為系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)建立的標(biāo)志。最早發(fā)現(xiàn)的水稻PR1家族成員OsPR1a和OsPR1b被報(bào)道受稻瘟病菌及環(huán)境脅迫和一些化學(xué)物質(zhì)的廣泛誘導(dǎo)[6],但有關(guān)它們?cè)谒靖鱾€(gè)組織中的具體表達(dá)模式和誘導(dǎo)特性的信息仍然非常有限。啟動(dòng)子的起始往往間接反映基因的表達(dá)情況,因此,我們通過(guò)構(gòu)建OsPR1bp::GUS表達(dá)載體和Real-time PCR,分析了OsPR1b的活性和表達(dá)特征,旨在進(jìn)一步探索水稻SAR 誘導(dǎo)過(guò)程和OsPR1b基因表達(dá)的內(nèi)在關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        水稻品種日本晴(O.sativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare)和石狩白毛(O.sativaL.ssp.japonicacv.Ishikari-shiroge,I-S)由本實(shí)驗(yàn)室提供;大腸桿菌DH5α、根瘤農(nóng)桿菌EHA105和水稻白葉枯菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)菲律賓生理小種P10(PXO124)均為本實(shí)驗(yàn)室保存;雙元載體Pnos-HPT-T35S-GUS-Tnos 由本實(shí)驗(yàn)室在pCAMBIA0380載體基礎(chǔ)上改造獲得;pMD19-T載體、Pyrobest DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司;總DNA 提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit 購(gòu) 自Qiagen 公 司;TRIzol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司;iScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Sso-Fast EvaGreen Supermix 試劑盒均購(gòu)自Bio-Rad 公司;DNA 片段及質(zhì)?;厥赵噭┖匈?gòu)自Promega 公司;BamHⅠ和KpnⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自NEB 公司;T4DNA 快速連接酶購(gòu)自Fermentas 公司;X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸)購(gòu)自PhytoTechnology Laboratories 公司;甲基茉莉酸(methyl jasmonate,JA)購(gòu)自TCI公司;乙酰水楊酸(salicylic acid,SA)購(gòu)自BBI公司;激動(dòng)素(kinetin,KT)購(gòu)自Sigma公司;3-吲哚乙酸(3-indole-acetic acid,IAA)、赤霉素(gibberellic acid,GA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)和乙烯利(ethephon,ETH)均購(gòu)自生工公司。

        1.2 啟動(dòng)子的克隆與載體構(gòu)建

        根 據(jù) NCBI 中的水 稻OsPR1b(LOC_Os01g28450.1)基因組序列,利用Oligo 軟件設(shè)計(jì)引物,用于擴(kuò)增基因啟始密碼子ATG 前約2.5 kb 的啟動(dòng)子序列,并在上、下游引物中分別引入BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn),便于和GUS報(bào)告基因表達(dá)載體連接。引物由上海生工生物工程公司合成,序列見(jiàn)表1。按照DNeasy Plant Mini 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取水稻日本晴總DNA,并以此DNA 為模板、OsPR1bp-F/R為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,體系參照Pyrobest DNA 聚合酶說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增條件為94℃ 5 min,然后以94℃30 s、58℃30 s、72℃2.5 min 行33 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后,加入rTaq DNA 聚合酶,繼續(xù)在72℃反應(yīng)10 min 加“A”,獲得的啟動(dòng)子片段大小為2593 bp。用T4DNA 連接酶于25℃連接30 min,將回收純化的啟動(dòng)子片段連入pMD19-T 載體中。PCR 鑒定正確后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的日本晴序列一致。將連有啟動(dòng)子片段的pMD19-T 載體用BamHⅠ和KpnⅠ酶切,回收片段后,連入經(jīng)同樣酶切的GUS表達(dá)載體中。

        1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

        將構(gòu)建得到的OsPR1bp::GUS表達(dá)載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 中,參考Hiei 等[7]的轉(zhuǎn)基因方法,再將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入石狩白毛成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中,獲得相應(yīng)的OsPR1bp::GUS轉(zhuǎn)基因植株。

        1.4 GUS組織化學(xué)染色

        GUS 組織化學(xué)染色法參照J(rèn)efferson 等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)入OsPR1bp::GUS的愈傷組織經(jīng)首輪篩選21 d 后,隨機(jī)挑選抗性愈傷進(jìn)行染色,其他植物組織取自T2代轉(zhuǎn)基因植株。用Nikon SMZ1000立體顯微鏡拍攝,拍攝前將含有葉綠素的樣品置于100%酒精中進(jìn)行脫色處理。染色液成分包括1 mmol/L X-gluc[溶于0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)中]、10 mmol/L Na2EDTA、1 mmol/L 鐵氰化鉀、1 mmol/L 亞鐵氰化鉀、20%甲醇和0.5% Triton X-100。

        表1 引物及序列

        1.5 試驗(yàn)水稻的處理

        水稻石狩白毛種植于浙江省農(nóng)科院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所溫室內(nèi),采用國(guó)際水稻所(IRRI)水稻營(yíng)養(yǎng)液配方進(jìn)行培養(yǎng)。水稻胚性愈傷用含2 mg/L 2,4-D 的NB 培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得。取2 周齡根、莖、葉(第四葉),抽穗期帶花幼穗和劍葉,1 月齡胚性愈傷組織進(jìn)行RNA 提取和定量PCR,分析OsPR1b基因的組織表達(dá)特性。

        轉(zhuǎn)基因水稻石狩白毛種子溶液培養(yǎng)于溫室內(nèi)(生長(zhǎng)條件:白天30℃,夜晚25℃,相對(duì)濕度60%~80%,光周期12 h/d),待長(zhǎng)至四葉一心期時(shí),分別移至含0.1 mmol/L 激素、100 mmol/L NaCl 及10% 聚乙二醇(PEG)的溶液中,以無(wú)菌去離子水為對(duì)照,處理根部24 h 后分別采集葉片,制備樣品,用于分析OsPR1b基因啟動(dòng)子的非生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。

        培養(yǎng)條件同上,取3 周齡水稻幼苗。將培養(yǎng)好的水稻白葉枯菌致病菌株P(guān)10(PXO124)調(diào)至D600nm值為0.6~1.0,利用剪切接種法接種水稻幼苗,以無(wú)菌去離子水剪切為對(duì)照,接種24 h 后分別采集葉片,進(jìn)行樣品制備,用于分析OsPR1b基因啟動(dòng)子的生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。以上所取的每個(gè)材料均有3 個(gè)不同的生物學(xué)重復(fù)。

        1.6 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

        樣品用液氮速凍充分研磨后,加入1~2 mL TRIzol,按照TRIzol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA,待沉淀適度干燥后,用20~40μL 無(wú)RNase 的水溶解RNA。隨后采用iScript cDNA Synthesis 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成第一鏈cDNA。

        1.7 熒光定量PCR檢測(cè)

        Real-time PCR 反應(yīng)體系按SsoFast EvaGreen Supermix 試劑盒說(shuō)明書(shū)配制。擴(kuò)增條件為95℃ 5 min,以95℃10 s、58℃10 s、72℃20 s 行45 個(gè)循環(huán),最后72℃ 10 min。在40℃~95℃溫度范圍內(nèi),95℃10 min,40℃10 min,再緩慢提高至95℃,反應(yīng)結(jié)束冷卻至40℃繪制熔解曲線(xiàn)。Real-time PCR所用儀器為L(zhǎng)ightCycler 480 real-time PCR 儀(Roche公司)。采用比較Ct值的方法進(jìn)行相對(duì)定量,以管家基因OsActin作為內(nèi)標(biāo)校正模板量,計(jì)算公式為2-ΔΔCt。Real-time PCR 引物見(jiàn)表1。

        2 結(jié)果

        2.1 啟動(dòng)子的序列分析

        以已知的OsPR1b基因(LOC_Os01g28450.1)5'端上游3 kb的區(qū)域作為啟動(dòng)子搜索對(duì)象,在PLACE網(wǎng)站(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)進(jìn)行搜索和掃描,對(duì)其中潛在的一些順式作用元件進(jìn)行分析(圖1)。結(jié)果表明,OsPR1b啟動(dòng)子序列除了包含核心啟動(dòng)元件及CAAT 盒之外[9],還包含W box、TGA element、A box、-624 box、AuxRE 等一些被報(bào)道的順式調(diào)控元件(表2)。表明OsPR1b基因可能受多重信號(hào)分子的調(diào)控。

        2.2 啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

        用BamH Ⅰ和KpnⅠ分別雙酶切Pnos-HPTT35S-GUS-Tnos 載體和重組質(zhì)粒pMD19-T-Os-PR1bp(圖2B),再經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和PCR驗(yàn)證后獲得相應(yīng)的啟動(dòng)子表達(dá)分析載體OsPR1bp::GUS(圖2A)。

        2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

        通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選和轉(zhuǎn)基因植株的再生,共獲得了68 個(gè)T0代株系,經(jīng)PCR 分子鑒定及GUS 組織染色分析,得到58 個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系,其中24 個(gè)株系GUS 組織染色呈陽(yáng)性;隨機(jī)挑選部分具有GUS 活性的株系進(jìn)行繁種,得到T2代株系后進(jìn)行系統(tǒng)的GUS組織化學(xué)分析。

        2.4 OsPR1b 基因啟動(dòng)子在器官或組織中的特異性表達(dá)

        圖1 OsPR1b啟動(dòng)子中所預(yù)測(cè)的部分脅迫響應(yīng)元件位置

        表2 OsPR1b啟動(dòng)子中的順式作用元件詳情

        特定的啟動(dòng)子起始過(guò)程常常決定了某個(gè)基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)或表達(dá)量的多少。通過(guò)分析OsPR1b啟動(dòng)子在各個(gè)器官或組織中驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)情況,可以在一定程度上反映它所控制的OsPR1b基因的時(shí)空表達(dá)特性。為此,我們對(duì)轉(zhuǎn)OsPR1bp::GUS抗性愈傷組織、T1代轉(zhuǎn)基因植株的種子及T2代植株的不同部位進(jìn)行了GUS 組織化學(xué)分析,同時(shí),利用Real-time PCR 對(duì)野生型愈傷組織和水稻不同時(shí)期各組織(14 d 根、莖、葉;開(kāi)花期劍葉、小花)中OsPR1b基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析(圖3)。結(jié)果表明,GUS基因在各組織中的表達(dá)差異很大,大部分組織均呈現(xiàn)低水平的GUS 活性,葉片中的GUS 染色較為明顯,在5 日齡的幼苗中主要集中在葉尖處,葉緣及節(jié)間上也有部分活性(圖3,a~e),在2 周齡的植株葉片及開(kāi)花期的劍葉中則可以觀(guān)察到較為明顯GUS 染色,這些葉片上的染色模式基本上表現(xiàn)為不規(guī)則斑點(diǎn)狀分布(圖3,f~i)。另外,在抗性愈傷及萌發(fā)的種胚中也存在GUS基因表達(dá)的跡象(圖3,l、m)。而在其他部位,如莖、根、花中均未觀(guān)察到明顯的GUS活性(圖3,a、j、k)。Real-time PCR 的結(jié)果也顯示,OsPR1b在葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織(圖3n)。這些結(jié)果證明,OsPR1b基因主要在葉片部位表達(dá),從而發(fā)揮其抗病的生物學(xué)功能。

        圖2 OsPR1bp::GUS表達(dá)載體的構(gòu)建(A)及質(zhì)粒酶切電泳圖(B)

        2.5 OsPR1bp的誘導(dǎo)表達(dá)特性

        為了了解所分離的啟動(dòng)子片段對(duì)不同信號(hào)分子的響應(yīng)變化,我們對(duì)2 周齡水稻苗的根部進(jìn)行了各種處理,并利用Real-time PCR 技術(shù)對(duì)水稻第四葉和根部OsPR1b基因的表達(dá)變化進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果顯示,在直接接觸激素的根部,MeJA和KT 可誘導(dǎo)OsPR1b表達(dá)增強(qiáng),誘導(dǎo)倍數(shù)分別為17.91±2.27和4.13±2.14;鹽脅迫處理也可顯著提高基因的表達(dá)水平,達(dá)到了33.09±2.01 倍;其他信號(hào)分子,除了H2O2的處理沒(méi)有明顯差異外,基因的表達(dá)量均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。在水稻的第四葉,KT和ABA可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)OsPR1b的表達(dá)改變,基因的表達(dá)量分別提高了196.8±5.19和62.85±9.12 倍;鹽脅迫和H2O2處理時(shí)則分別提高了4.81±1.68和3.00±0.47 倍;其他處理情況下,除了GA 處理抑制外,均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)趨勢(shì),其中,抗病信號(hào)分子SA和MeJA 的上調(diào)變化并不顯著。不論是在根中還是葉片,經(jīng)過(guò)不同激素和非生物脅迫的處理,OsPR1b基因的表達(dá)差異變化不大,只有少數(shù)幾種激素和鹽脅迫的處理較為顯著,這暗示著OsPR1b基因的表達(dá)主要受少數(shù)信號(hào)途徑的調(diào)控。

        圖3 OsPR1bp::GUS轉(zhuǎn)基因水稻的GUS染色和OsPR1b基因在健康組織中的表達(dá)情況

        圖4 激素和非生物脅迫處理24 h后OsPR1b的誘導(dǎo)表達(dá)特征

        為了闡明水稻致病菌與OsPR1b基因的互作關(guān)系,以及抗病信號(hào)分子SA和MeJA 在此過(guò)程中的作用,我們利用水稻白葉枯菌毒性菌株P(guān)10(PXO124)對(duì)2 周齡水稻苗第四葉和第五葉進(jìn)行接種,同時(shí)用SA和MeJA 溶液處理其根部。共同處理24 h 后,分別取第四葉和第五葉進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析(圖5),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與接水對(duì)照相比,單獨(dú)接種Xoo后Os-PR1b基因的表達(dá)量變化并不顯著;而SA 共同處理組則表現(xiàn)為微弱的上調(diào)趨勢(shì),其中第四葉的變化較為明顯;有意思的是,當(dāng)同時(shí)進(jìn)行接種Xoo和MeJA處理后,OsPR1b基因的表達(dá)量受到了明顯的誘導(dǎo),與對(duì)照相比,第四葉和第五葉中分別提高了約17 倍和8倍。這表明MeJA很可能在植物對(duì)抗Xoo侵染的過(guò)程中起著某種重要的作用。

        圖5 水稻白葉枯菌PXO124菌株和SA、MeJA共同處理24 h后OsPR1b基因表達(dá)水平的變化

        3 討論

        作為一種分子標(biāo)記基因,OsPR1b的表達(dá)在健康植物的葉片中幾乎是沉默的[6],在OsPR1bp轉(zhuǎn)基因水稻中,我們也僅在葉片中觀(guān)察到了明顯的GUS活性,而在其他所有組織中的表達(dá)十分微弱,甚至不能被檢測(cè)到。Real-time PCR 結(jié)果也顯示,在同一組織如根中,OsPR1b基因的Ct值和管家基因Actin相比較,有10個(gè)循環(huán)以上的差異。OsPR1bp在幼葉中的表達(dá)主要分布在葉尖和葉緣等一些細(xì)胞分裂較為旺盛的部位,這表明OsPR1bp很可能參與了水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。同樣,在萌動(dòng)的種胚內(nèi)也出現(xiàn)了GUS活性,事實(shí)上,通過(guò)進(jìn)一步的掃描啟動(dòng)子序列,我們發(fā)現(xiàn)在基因的上游存在數(shù)個(gè)與種子萌發(fā)相關(guān)的POLASIG1 元件(核心序列為AATAAA)[15]。到了水稻秧苗期和開(kāi)花期,葉片上的GUS 染色呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀的隨機(jī)分布,我們推測(cè)這種表達(dá)模式可能和OsPR1b的抗病性有關(guān)。

        茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯是脂源性激素分子,調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面,調(diào)控對(duì)非生物及生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。用JA 處理水稻后會(huì)誘導(dǎo)許多PR基因如OsPR1b 基因的表達(dá)[16]。然而,PR 的誘導(dǎo)表達(dá)屬于較晚期的事件[17],我們的實(shí)驗(yàn)表明接種Xoo或JA 單獨(dú)處理根部24 h 后,葉片中OsPR1b的表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯的上調(diào)變化,但在水稻受到Xoo侵染時(shí),外源施加JA 可以顯著增強(qiáng)OsPR1b基因的表達(dá)量,從而增強(qiáng)植株的抗病性,這與已報(bào)道的外源施加JA 確實(shí)能提高水稻植株抗白葉枯病能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[18]。

        通常,水稻葉片中存在高水平的自由態(tài)SA[19],內(nèi)源性SA 水平的提高對(duì)于水稻防御反應(yīng)的影響似乎并不顯著[20],PR基因在SA 缺陷的NahG 水稻中的表達(dá)也并沒(méi)有因?yàn)镾A 的缺乏而顯著減弱[21],而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,在Xoo侵染后24 h,SA 的外源施加也不能引起OsPR1b表達(dá)量的顯著增加。然而,SA信號(hào)通路的一個(gè)重要調(diào)節(jié)者NPR1,被證明在水稻抗白葉枯病的過(guò)程中起重要作用,它能夠和許多TGA家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用,將其在水稻中超表達(dá)后能夠極大地提高水稻對(duì)Xoo的抗性,同時(shí)也激活了一系列防御相關(guān)基因[22]。在擬南芥中,TGA3 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素(CTK)的轉(zhuǎn)錄激活因子ARR2 結(jié)合于PR1啟動(dòng)子上,從而激活CTK 響應(yīng)的防御基因的轉(zhuǎn)錄[23]。在OsPR1b基因啟動(dòng)子上我們也發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)TGA結(jié)合的順式作用元件,Real-time PCR 結(jié)果也證明KT 確實(shí)能夠顯著增強(qiáng)OsPR1b的表達(dá)水平,所以我們推測(cè)在水稻中KT 對(duì)OsPR1b基因的誘導(dǎo)變化很可能也是通過(guò)調(diào)節(jié)SA-NPR1 的信號(hào)路徑,最終影響水稻對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)。

        值得注意的是,在根中鹽脅迫的誘導(dǎo)非常明顯,2個(gè)模擬干旱的非生物因子NaCl和PEG 均能不同程度地提高葉片中OsPR1b的表達(dá)水平。ABA 調(diào)節(jié)著植物生長(zhǎng)和發(fā)育的許多生理過(guò)程,它在水稻對(duì)鹽、干旱和寒冷等非生物脅迫的耐受性方面所起的作用已得到廣泛研究[24],近期的研究也表明,干旱條件下水稻植株會(huì)產(chǎn)生MeJA,進(jìn)而刺激產(chǎn)生ABA[25],而我們的研究結(jié)果也證明根部施加ABA 確實(shí)能夠顯著增強(qiáng)OsPR1b在葉片的表達(dá)。因此,我們推斷干旱條件誘導(dǎo)OsPR1b基因的表達(dá)很可能是通過(guò)刺激水稻植株產(chǎn)生ABA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

        GA 通常被認(rèn)為是水稻內(nèi)部免疫反應(yīng)的負(fù)控調(diào)節(jié)者[26],據(jù)報(bào)道調(diào)節(jié)GA 水平的OsGA20ox3轉(zhuǎn)基因植株可改變水稻對(duì)Xoo及稻瘟病的抗性,PR1的誘導(dǎo)表達(dá)水平及SA和JA 的積累水平也確實(shí)受到了GA水平的影響[27]。這和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,即GA 有可能通過(guò)抑制如OsPR1b基因的表達(dá)而增加水稻的感病性。

        總之,根據(jù)我們現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和前人的研究,我們推測(cè),OsPR1b基因可通過(guò)JA、KT和ABA 等激素水平的調(diào)控整合到了水稻生物和非生物信號(hào)傳導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò),從而對(duì)Xoo侵染或鹽/干旱脅迫做出響應(yīng),同時(shí)SA-NPR1 的信號(hào)通路可能在其中發(fā)揮重要作用。當(dāng)然,我們也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,PR基因作為一種較為敏感的基因,它的表達(dá)還受到多種因素如生理因素的影響[28]。目前,我們已構(gòu)建和積累了部分突變體材料,希望通過(guò)研究OsPR1b基因在這些突變體中的表達(dá)變化,以進(jìn)一步明確OsPR1b基因在水稻中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

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