曲國(guó)龍 ，邵妤，2，譚俊杰，陳章，金晶，4，凌焱，李玉霞，劉剛，陳惠鵬

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230039；3.成都軍區(qū)總醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 610083；4.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016

合成生物學(xué)（synthetic biology）是后基因組時(shí)代的新興學(xué)科，同時(shí)也是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1]。合成生物學(xué)新在“合成”二字，亦即一個(gè)再創(chuàng)造的過(guò)程，旨在以傳統(tǒng)的生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合工程學(xué)、材料學(xué)、計(jì)算科學(xué)等其他學(xué)科的技術(shù)方法進(jìn)行人工定向創(chuàng)造[2-3]。其涵蓋的研究?jī)?nèi)容可大體分為3 個(gè)層次[4]：一是利用已知功能的天然生物模體（motif）或模塊（module）構(gòu)建新型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并表現(xiàn)出新功能；二是采用從頭合成（de novosynthesis）的方法，人工合成基因組DNA 并重構(gòu)生命體；第三個(gè)層次則是在前兩個(gè)研究領(lǐng)域得到充分發(fā)展之后，創(chuàng)建完整的全新生物系統(tǒng)乃至人工生命體（artificial life）。

近20 年來(lái)，合成生物學(xué)研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。2000 年，《Science》發(fā)文報(bào)道了2 個(gè)人工合成的基因網(wǎng)絡(luò)基因震蕩器（oscillator）[5]和基因開(kāi)關(guān)（toggles witch）[6]；2002 年，Wimmer[7]研究組在歷史上首次合成具有生物活性的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組；2010 年5 月20 日，Venter[8]研究組通過(guò)將人工合成的支原體基因組移植到山羊支原體細(xì)胞，創(chuàng)造了首個(gè)僅由人造基因組控制的活細(xì)胞。這些具有里程碑意義的研究，充分體現(xiàn)了合成生物學(xué)廣闊的前景及潛在的應(yīng)用價(jià)值。比如，Keasling[9]等合成抗瘧藥物青蒿素和Voigt[10]等通過(guò)人工改造的細(xì)菌進(jìn)行抗癌等經(jīng)典研究工作，皆顯示了合成生物學(xué)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，微溶于水，易形成尿酸鹽晶體沉淀，長(zhǎng)期的高尿酸血癥易引發(fā)痛風(fēng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，耐輻射異常球菌中，基因hucR編碼的蛋白HucR 在尿酸介導(dǎo)下，可以與基因hucO產(chǎn)生相互作用[11-12]，其作用原理是當(dāng)尿酸濃度低于某一值時(shí)HucR 與hucO相結(jié)合，對(duì)hucO下游基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)尿酸濃度高于某一值時(shí)，HucR 與hucO分離，hucO下游基因正常表達(dá)。2010年，有研究人員通過(guò)合成的基因回路實(shí)現(xiàn)了小鼠體內(nèi)尿酸的穩(wěn)態(tài)控制[13]。在本研究中，我們以mUTs（連有KRAB 結(jié)構(gòu)域的hucR基因）和hucO8（hucO的8串聯(lián)結(jié)構(gòu)）為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建雙載體基因回路和雙向共表達(dá)單載體基因回路，進(jìn)一步研究分析細(xì)胞水平上回路對(duì)尿酸的感應(yīng)及調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa 細(xì)胞、載體pcDNA3.1/V5-His（C）由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；載體pSEAP2-control 購(gòu)自Clontech 公司；載體pBudCE4.1、轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000和Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit 均購(gòu)自Invitrogen 公司；dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶均購(gòu)自NEB 公司；DNA marker購(gòu)自Trans和TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen 公司；LATaqDNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司；報(bào)告基因SEAP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TOYOBO 公司；DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自GIBCO 公司；DMSO 購(gòu)自Sigma 公司；胰蛋白酶購(gòu)自HyClone 公司；24 孔和96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Costar 公司；尿酸干粉購(gòu)自ACROS 公司；DNA 合成和測(cè)序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 mUTs及hucO8的合成

從NCBI 網(wǎng)站獲 取mUTs及hucO8的序列，在mUTs的5'和3'端分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，hucO8的5'和3'端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，人工合成2 段基因序列并連接至pMD18T 載體，分別命名為pMD18T-mUTs和pMD18T-hucO8。

1.3 mUTs基因的改造

通過(guò)PCR 在mUTs的5'端引入NotⅠ位點(diǎn)，3'端引入BglⅡ位點(diǎn)。用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)PCR 上游引物P1（5'-GCGGCCGCGAATTCATGGATGCTA AGTCACTAA-3'，下劃線序列為NotⅠ位點(diǎn)）和下游引物P2（5'-AGATCTTCTAGATTATACCCCCTGCTC CAGCCC-3'，下劃線序列為BglⅡ位點(diǎn)）。PCR 模板為pMD18T-mUTs，PCR 擴(kuò)增體系（25μL）包括DNA模板100 ng、LATaq（5 U/μL）酶0.3μL、引物（100μmol/L）各1μL、5×GC 緩沖液5μL、dNTP（2.5 mmol/L）4μL，用ddH2O 補(bǔ)至25μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，然后以94℃變性30 s、65℃退火1 min、72℃延伸1 min 擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min?；厥漳康漠a(chǎn)物連接至pMD18T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切及測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性克隆命名為pT-NmUTsB。

1.4 載體pSEAP-hucO8的構(gòu)建

以pMD18T-hucO8和pSEAP2-control 為基礎(chǔ)載體，用HindⅢ/EcoRⅠ對(duì)載體分別進(jìn)行雙酶切，2%和1%的瓊脂糖凝膠電泳分別分離回收pMD18T-hucO8小片段及pSEAP2-control 大片段，用T4DNA 連接酶連接2個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.5 轉(zhuǎn)錄抑制物表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-mUTs的構(gòu)建

以pMD18T-mUTs和pcDNA3.1/V5-His（C）為基礎(chǔ)載體，用EcoRⅠ/NotⅠ對(duì)載體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pMD18T-mUTs 小片段及pcDNA3.1/V5-His（C）大片段，用T4DNA 連接酶連接2個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.6 雙向共表達(dá)載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs 的構(gòu)建

首先構(gòu)建pBudCE4.1-SEAP。以pBudCE4.1和pSEAP-hucO8為基礎(chǔ)載體，用HindⅢ/SalⅠ對(duì)載體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pSEAP-hucO8小片段（hucO8-SEAP）及pBudCE4.1 大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

以pBudCE4.1-SEAP和pT-NmUTsB 為基礎(chǔ)載體，用NotⅠ/BglⅡ?qū)d體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pT-NmUTsB 小片段及pBudCE4.1-SEAP 大片段，用T4DNA 連接酶連接2個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.7 載體phucO8-smUox的構(gòu)建

從NCBI 網(wǎng)站獲取smUox序列，人工合成該基因序列并連接至pGH 載體，命名為pGH-smUox。以pSEAP-hucO8和pGH-smUox 為基礎(chǔ)載體，用EcoRⅠ/XbaⅠ對(duì)載體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pGH-smUox 小片段及pSEAP-hucO8大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.8 單載體UA 調(diào)控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox的構(gòu)建

首先構(gòu)建載體pBudCE4.1-smUox。以載體phucO8-smUox和pBudCE4.1 為基礎(chǔ)載體，用Hind Ⅲ/BamHⅠ對(duì)載體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收phucO8-smUox 小片段（hucO8-smUox）及pBudCE4.1 大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

然后以pBudCE4.1-smUox和pBudCE4.1-SEAP-mUTs為基礎(chǔ)載體，用NotⅠ/BglⅡ?qū)d體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收pBudCE4.1-SEAP-mUTs 小片段及pBudCE4.1-smUox 大片段，用T4DNA 連接酶連接2 個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.9 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HeLa 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇后傳代2～3次，至細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前24 h接種HeLa 細(xì)胞到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約1.0×105細(xì)胞，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右。轉(zhuǎn)染步驟詳見(jiàn)LipofectAMINE 2000說(shuō)明書(shū)。

1.10 報(bào)告基因SEAP檢測(cè)

用Reporter Assay Kit（-SEAP-）在Enspire Multilabel Reader（Perkin Elmer）上檢測(cè)分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）的表達(dá)量。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)時(shí)間為24～48 h，SEAP 的表達(dá)是一個(gè)持續(xù)的過(guò)程，48 h 后表達(dá)量相對(duì)較大，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)較好。具體步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.11 20 mmol/L尿酸溶液的配制

配制100 mL 50 mmol/L（pH10.0）的Tris-HCl溶液，稱取336 mg UA 粉末，倒入Tris-HCl 溶液中，攪拌至UA粉末完全溶解，用0.22μm的一次性過(guò)濾器過(guò)濾后用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.12 尿酸及尿酸酶檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后48 h，用Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit 在Enspire Multilabel Reader 上檢測(cè)尿酸及尿酸酶含量，檢測(cè)波長(zhǎng)560 nm。具體步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 載體pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs 的構(gòu)建

挑取構(gòu)建后載體的單克隆，用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，結(jié)果如圖1A，250 bp 偏上條帶與目的片段（274 bp）相符，說(shuō)明載體pSEAP-hucO8構(gòu)建成功。

挑取構(gòu)建后載體的單克隆，用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，結(jié)果如圖1B，1000 bp 處出現(xiàn)條帶，與目的片段（974 bp）相符，說(shuō)明載體pcDNA3.1/V5-mUTs構(gòu)建成功。

2.2 載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs的構(gòu)建

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，結(jié)果如圖2A，1000 bp 處出現(xiàn)目的條帶；目的條帶連接至pMD18T 載體，用NotⅠ/BglⅡ雙酶切，電泳結(jié)果如圖2B，部分樣品出現(xiàn)目的條帶，測(cè)序分析出現(xiàn)目的條帶的單克隆樣品，結(jié)果正確，說(shuō)明在mUTs的5'和3'端成功引入NotⅠ和BglⅡ位點(diǎn)。挑取構(gòu)建的pBudCE4.1-SEAP 單克隆，用HindⅢ/SalⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2C，2000 bp 偏上出現(xiàn)條帶，與目的片段（2301 bp）相符，說(shuō)明載體pBudCE4.1-SEAP 構(gòu)建成功。挑取構(gòu)建的pBudCE4.1-SEAP-mUTs 單克隆，分別用HindⅢ/SalⅠ和NotⅠ/BglⅡ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2D，3 個(gè)單克隆樣品均出現(xiàn)與2 個(gè)目的片段大小相符的條帶，說(shuō)明載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs構(gòu)建成功。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定pSEAP-hucO8（A）和

2.3 單載體UA 調(diào)控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox的構(gòu)建

挑取phucO8-smUox 載體單克隆，用EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3A，1000 bp 處出現(xiàn)條帶，與目的片段（985 bp）相符，說(shuō)明載體phucO8-smUox 構(gòu)建成功。挑取pBudCE4.1-smUox 載體單克隆，用HindⅢ/BamHⅠ雙酶切，結(jié)果如圖3B，1500～2000 bp 間出現(xiàn)條帶，與目的片段（1755 bp）相符，說(shuō)明pBudCE4.1-smUox 構(gòu)建成功。以NotⅠ/BglⅡ?yàn)槊盖形稽c(diǎn)，在pBudCE4.1-smUox 載體上連入mUTs，完成載體pBudCE4.1-mUTs-smUox的構(gòu)建。用HindⅢ/BamHⅠ和NotⅠ/BglⅡ分別進(jìn)行雙酶切，結(jié)果如圖3C，出現(xiàn)2 個(gè)與目的片段（985、1755bp）相符的條帶，且大片段正確，說(shuō)明載體pBudCE4.1-mUTs-smUox構(gòu)建成功。

2.4 雙載體基因回路基本功能驗(yàn)證

圖2 載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs構(gòu)建的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

圖3 載體pBudCE4.1-mUTs-smUox構(gòu)建的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

以不同濃度LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染pSEAPhucO8（每孔0.8μg）至HeLa 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清進(jìn)行SEAP化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)，結(jié)果如圖4A，隨著LipofectAMINE 2000 濃度的提高，SEAP 的表達(dá)量增加，說(shuō)明pSEAP-hucO8轉(zhuǎn)入細(xì)胞后SEAP基因可以正常表達(dá)。以不同摩爾比共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8（固定每孔0.8μg），2 種質(zhì)粒與LipofectAMINE 2000 分別稀釋、混合，轉(zhuǎn)染時(shí)每孔各加入100μL 混合液，轉(zhuǎn)染6 h 后換液，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)，結(jié)果如圖4B，相比于單獨(dú)轉(zhuǎn)染pSEAP-hucO8，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8時(shí)，SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著降低，且隨著mUTs/hucO8比例的提高，SEAP發(fā)光強(qiáng)度逐漸緩慢降低。說(shuō)明mUTs可以正常表達(dá)且能與hucO8結(jié)合并抑制下游基因表達(dá)，隨著mUTs/hucO8摩爾比的提高，抑制作用增強(qiáng)。

2.5 單載體回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs 基本功能驗(yàn)證

以不同濃度的LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-SEAP（每孔1.0μg）至HeLa 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清進(jìn)行SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)，結(jié)果如圖5A，隨著LipofectAMINE 2000 濃度的提高，SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明pBudCE4.1-SEAP 轉(zhuǎn)入細(xì)胞后SEAP基因可以正常表達(dá)；然后分別以不同摩爾比轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-SEAP-mUTs（每孔1.2μg）和pcDNA3.1/V5-mUTs，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)SEAP化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖5B，實(shí)驗(yàn)組相比于陰性對(duì)照組SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯降低，且mUTs/hucO8比例越高，發(fā)光強(qiáng)度越低。說(shuō)明pBudCE4.1-SEAP-mUTs 載體上mUTs可以正常表達(dá)且能與hucO8結(jié)合并對(duì)下游基因表達(dá)起到一定的抑制作用，且mUTs/hucO8比例越高，抑制作用越明顯。cO8/mUTs=1∶4。

2.6 回路對(duì)尿酸感應(yīng)作用分析

通過(guò)檢測(cè)不同濃度尿酸培養(yǎng)時(shí)SEAP 的表達(dá)量來(lái)驗(yàn)證回路對(duì)尿酸的感應(yīng)作用。以4∶1 的比例共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8或者單獨(dú)轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-SEAP-mUTs，轉(zhuǎn)染6 h 后換液并添加不同濃度的UA，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測(cè)SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。共轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖6A，0～0.3 mmol/L 范圍內(nèi)SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度基本不變，0.4～2.0 mmol/L 范圍內(nèi)SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但變化不大；單獨(dú)轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-SEAP-mUTs 結(jié)果如圖6B，0～2.0 mmol/L 范圍內(nèi)SEAP 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且變化明顯。結(jié)果表明，雙載體回路和單載體回路均具有一定的尿酸感應(yīng)能力，單載體回路在0～0.3 mmol/L 尿酸濃度范圍內(nèi)感應(yīng)作用不明顯，0.4～2.0mmol/L范圍內(nèi)感應(yīng)作用明顯，但變化不大；單載體回路在0～2.0 mmol/L 范圍內(nèi)對(duì)UA 的感應(yīng)作用逐漸增強(qiáng)且變化明顯。

圖4 雙載體基因回路基本功能驗(yàn)證（SEAP化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)）

圖5 單載體回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs基本功能驗(yàn)證（SEAP化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)）

2.7 回路對(duì)尿酸調(diào)控作用分析

單獨(dú)轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-smUox，檢測(cè)smUox能否在HeLa 細(xì)胞中正常表達(dá)，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測(cè)培養(yǎng)基中尿酸酶的含量，結(jié)果如圖7A，隨著pBudCE4.1-smUox 濃度的提高，培養(yǎng)基中尿酸酶含量逐漸增加。設(shè)計(jì)不同的分組實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)回路對(duì)尿酸的調(diào)控作用，轉(zhuǎn)染6 h 后換液，每孔加入500μmol/L 尿酸，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)培養(yǎng)基中的UA含量，結(jié)果如圖7B，與陰性對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中UA濃度均有所下降。最后以3∶1 的摩爾比共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-mUTs和pBudCE4.1-mUTs-smUox，轉(zhuǎn)染6 h后換液，分別添加不同濃度的UA，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測(cè)培養(yǎng)基中的UA 濃度，以此檢驗(yàn)回路對(duì)UA 的調(diào)控能力及調(diào)控范圍，結(jié)果如圖7C，0～300μmol/L 范圍內(nèi)尿酸濃度基本不變，500～2000μmol/L 范圍內(nèi)尿酸濃度均有所下降，且初始濃度越高，下降幅度越大。綜合分析表明，smUox轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞后可以正常表達(dá)并具有活性；單載體回路及雙載體回路均具有一定的尿酸調(diào)控能力，且尿酸調(diào)控能力相當(dāng)；當(dāng)mUTs/hucO8=4∶1 時(shí)，回路對(duì)尿酸的調(diào)控作用略有增強(qiáng)，但變化不大；尿酸濃度為0～2000μmol/L，pcDNA3.1/V5-mUTs 與pBudCE4.1-mUTs-smUox 的摩爾比為3∶1時(shí)，0～300μmol/L 范圍內(nèi)回路對(duì)尿酸基本沒(méi)有調(diào)控作用，500～2000μmol/L 范圍內(nèi)，隨著尿酸濃度增高，回路的降尿酸作用相對(duì)越強(qiáng)。

3 討論

合成生物學(xué)作為我國(guó)亟待發(fā)展的前沿科學(xué)正逐步被了解和重視，雖然目前還處于起步階段，但從現(xiàn)有研究成果不難看出，其在生物醫(yī)藥、能源、環(huán)境污染治理、生物傳感器和軍事等諸多領(lǐng)域具有極好的應(yīng)用前景。利用已知功能的基因片段，人工合成一些新的基因裝置或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而定向改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞的代謝行為，是合成生物學(xué)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

圖6 回路對(duì)尿酸感應(yīng)作用分析

圖7 回路對(duì)尿酸調(diào)控作用分析

本研究中，我們合成的基因回路就是利用了耐輻射異常球菌基因組中已知功能的基因hucR及其結(jié)合位點(diǎn)hucO。hucR經(jīng)過(guò)起始密碼子優(yōu)化，連接蛋白結(jié)構(gòu)域形成優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄抑制物基因mUTs，hucO經(jīng)過(guò)串聯(lián)形成結(jié)合位點(diǎn)的8串聯(lián)結(jié)構(gòu)hucO8，再以mUTs和hucO8為基礎(chǔ)，利用合成生物學(xué)的方法，定向構(gòu)建新的尿酸調(diào)控回路?；芈钒l(fā)揮功能的前提是：mUTs轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白mUTS 具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，且mUTS和hucO8在尿酸的介導(dǎo)下可以相互結(jié)合或分離?；芈返幕驹硎牵寒?dāng)尿酸低于某一濃度時(shí)，mUTS 與hucO8結(jié)合，抑制hucO8下游基因的表達(dá)；當(dāng)尿酸高于某一濃度時(shí)，mUTS 與hucO8分離，hucO8下游基因正常表達(dá)。尿酸酶具有分解尿酸的作用，當(dāng)我們把尿酸酶基因連入hucO8下游時(shí)，回路就可以對(duì)周?chē)h(huán)境中不同濃度的尿酸做出相應(yīng)的應(yīng)答。當(dāng)尿酸低于某一濃度時(shí)，回路關(guān)閉，不發(fā)揮調(diào)控作用；當(dāng)尿酸濃度高于某一濃度時(shí)，hucO8下游的尿酸酶基因正常表達(dá)，從而降低尿酸濃度，當(dāng)尿酸濃度降低至某一值時(shí)，mUTS與hucO8相結(jié)合，抑制尿酸酶基因的表達(dá)，使尿酸濃度穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)尿酸的調(diào)控。

我們首先利用優(yōu)化的基因片段mUTs和hucO8完成了載體pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8的構(gòu)建，組成了雙載體基因回路，通過(guò)HeLa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了mUTs和hucO8在尿酸介導(dǎo)下的相互作用；然后利用基因片段mUTs和hucO8合成了雙向共表達(dá)載體pBudCE4.1-SEAP-mUTs，實(shí)現(xiàn)了單載體基因回路的構(gòu)建，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了單載體回路上mUTs和hucO8在尿酸介導(dǎo)下的相互作用；最后通過(guò)連入優(yōu)化的黃曲霉菌尿酸酶基因smUox，構(gòu)建了單載體尿酸調(diào)控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox，通過(guò)檢測(cè)回路轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞后培養(yǎng)基中尿酸濃度的變化，驗(yàn)證了回路對(duì)尿酸的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)，mUTs與hucO8的比例對(duì)回路影響很大，當(dāng)二者比例為4∶1 時(shí)，mUTs對(duì)下游基因表達(dá)的抑制作用明顯增強(qiáng)，從而影響回路對(duì)尿酸的調(diào)節(jié)范圍及調(diào)節(jié)程度。鑒于LipofectAMINE 2000 的細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率等因素，我們沒(méi)有繼續(xù)增大二者比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

相比于雙載體基因回路，單載體基因回路具有以下特點(diǎn)：?jiǎn)屋d體基因回路可以規(guī)避轉(zhuǎn)染效率不定導(dǎo)致的轉(zhuǎn)入細(xì)胞的mUTs和hucO8比例不定的問(wèn)題，使得mUTs與hucO8可以按照1∶1 的比例轉(zhuǎn)入細(xì)胞；相比于通過(guò)共轉(zhuǎn)染才能實(shí)現(xiàn)的基因回路，單載體回路在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)操作的難度；單載體回路在很大程度上簡(jiǎn)化了后續(xù)研究中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選工作。

我們構(gòu)建的基因回路也存在一些問(wèn)題，與預(yù)期結(jié)果有一些差異。其中比較主要的問(wèn)題是，單載體和雙載體基因回路對(duì)尿酸都具有一定的感應(yīng)調(diào)節(jié)作用，但調(diào)節(jié)作用不夠理想。比如，尿酸濃度為1000～2000μmol/L時(shí)，雖然基因回路的降尿酸程度相對(duì)較大，但仍不能降至正常生理范圍內(nèi)。我們雖然發(fā)現(xiàn)當(dāng)mUTs與hucO8比例為4∶1 時(shí)對(duì)回路會(huì)有較大影響，但由于技術(shù)上的原因，未能成功構(gòu)建二者比例為4∶1 的單載體回路，為了達(dá)到更好的效果，仍須共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-mUTs 來(lái)提高mUTs的比例。我們通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法驗(yàn)證了回路對(duì)尿酸具有一定的感應(yīng)及調(diào)節(jié)能力，但由于沒(méi)有進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選，所以無(wú)法對(duì)尿酸濃度不斷變化時(shí)，回路是否具有可逆性及回路的長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。這些存在的問(wèn)題仍需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索解決。

正是合成生物學(xué)的興起與發(fā)展，才使得我們可以利用已知功能的生物模塊，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，合成新型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并使其表現(xiàn)出預(yù)期的功能。這種研究方法為一些代謝類疾病的基因及細(xì)胞水平上的治療提供了新的思路。相信隨著合成生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以合成生物學(xué)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究會(huì)逐步走向臨床應(yīng)用、走進(jìn)生活，在實(shí)踐中發(fā)揮更大的作用。

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