袁 音，朱鵬立，林 帆，余惠珍

(福建省立醫(yī)院老年科 福建省臨床老年病研究所 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350001)

研究論文

吡哆胺對(duì)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化因子表達(dá)的影響

袁 音，朱鵬立*，林 帆，余惠珍

(福建省立醫(yī)院老年科 福建省臨床老年病研究所 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350001)

目的探討吡哆胺對(duì)人近曲腎小管上皮HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化因子表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法以吡哆胺(P)和替米沙坦(T)分別干預(yù)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用的HK-2細(xì)胞，分為對(duì)照組、AngⅡ(10-6mol/L)組、AngⅡ分別加T(10-5mol/L)組、P(0.01、0.1、1和10 mmol/L)、T+P(1 mmol/L)組，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Annexin V-FITC雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)分析活性氧簇(ROS)水平，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)濃度，real-time PCR檢測(cè)糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、TGF-β1、CTGF和MMP-9 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)RAGE、TGF-β1、CTGF表達(dá)和NF-κB P65磷酸化水平。結(jié)果與AngⅡ組相比，吡哆胺和替米沙坦均增加HK-2細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞早期凋亡，降低細(xì)胞上清液AGEs濃度，減少ROS生成，下調(diào)RAGE、TGF-β1、CTGF、MMP-9 mRNA/蛋白表達(dá)和NF-κB P65磷酸化水平(均P﹤0.01)。吡哆胺的作用較替米沙坦顯著(P<0.05或P<0.01)，合用組的作用較替米沙坦單用組顯著(P<0.01)。結(jié)論吡哆胺可能通過降低AGEs-RAGE水平、改善氧化應(yīng)激以及減少NF-κB P65磷酸化，從而抑制細(xì)胞凋亡并下調(diào)纖維化分子表達(dá)。

吡哆胺；血管緊張素Ⅱ；糖基化終末產(chǎn)物；細(xì)胞凋亡；纖維化

近曲小管上皮細(xì)胞是腎小管間質(zhì)的主要功能細(xì)胞，在局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的影響下，細(xì)胞的增殖與凋亡動(dòng)態(tài)平衡被破壞，同時(shí)各類炎癥介質(zhì)及纖維化因子的表達(dá)上調(diào)，從而進(jìn)一步加速腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程[1- 2]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是糖基化反應(yīng)所生成的一系列終產(chǎn)物的總稱。目前認(rèn)為血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可通過促進(jìn)AGEs的生成，上調(diào)AGEs受體(RAGE)的表達(dá)來活化AGEs-RAGE，繼而通過激活氧化應(yīng)激及絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)和Smad等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響核因子-κB (NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子的活性，共同參與高血壓腎損害的發(fā)生[3]。吡哆胺是維生素B6的3種天然形式之一，是AGEs的強(qiáng)力抑制劑，之前研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠早期腎功能的損害具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不明確[4]。替米沙坦是一種特異性AT1受體拮抗劑，與AT1受體結(jié)合作用持久而可逆[5]。本實(shí)驗(yàn)通過與替米沙坦的比較，研究吡哆胺對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化因子表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人腎小管上皮HK-2細(xì)胞(ATCC)。AngⅡ、吡哆胺、替米沙坦、二苯基氯化碘鹽(DPI)、二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)、AnnexinV-FITC和MTT試劑盒(Sigma公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco公司)，ROS檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)，人AGEs ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D)，Trizol RNA提取試劑(Invitrogen公司)，real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司)，兔抗β-actin、TGF-β1、NF-κB P65、p-NF-κB P65多克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG和辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG (Bioworld公司)，兔抗RAGE單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)，小鼠抗CTGF單克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：HK-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)驗(yàn)分組：1)對(duì)照組不加任何藥物；2)AngⅡ組加10-6mol/L AngⅡ；3)替米沙坦(T)組10-5mol/L替米沙坦培養(yǎng)1 h后加AngⅡ；4)吡哆胺(P0.01、P0.1、P1和P10)組分別加0.01、0.1、1和10 mmol/L吡哆胺培養(yǎng)1 h后加AngⅡ；5)NADPH氧化酶抑制劑DPI組加10-5mol/L DPI，培養(yǎng)1 h后加AngⅡ；6) NF-κB抑制劑PDTC組加10-5mol/L PDTC，培養(yǎng)1 h后加AngⅡ。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞增殖至70%～80%匯合，脫血清同步化18 h后分組干預(yù)24和48 h。每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10～15 min后于ELISA檢測(cè)儀上以570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值。每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100。

1.2.3 磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-碘化吡啶(Annexin V-PI)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞增殖至70%～80%匯合,脫血清同步化18 h后分組干預(yù)24 h。取500 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度1.0×106/mL)至流式管中，分別加入5 μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-熒光探針FITC和10 μL碘化吡啶，混勻后于室溫避光反應(yīng)10 min，立即流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果判別：正常的活細(xì)胞不被染色，早期凋亡的細(xì)胞磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-熒光探針FITC染色陽性，碘化吡啶染色陰性，結(jié)果由CellQuest Pro軟件分析。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平的測(cè)定:細(xì)胞同步化18 h后分組干預(yù)24 h，6孔板每孔加入1 mL DCFH-DA探針(10 μmol/L)，設(shè)立無探針空白對(duì)照組，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，洗凈探針后取1 mL PBS重懸細(xì)胞立即于流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液AGEs濃度:設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔及待測(cè)樣品孔，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。終止反應(yīng)后以酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與吸光度值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RAGE、TGF-β1、CTGF和MMP-9 mRNA表達(dá):細(xì)胞同步化18 h后干預(yù)24 h，Trizol法提取總RNA,取2 μg RNA樣品，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由大連寶生物公司合成(表1)。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；反應(yīng) 95 ℃ 5 s，6 0℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))；分解 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參校正每個(gè)樣本的循環(huán)閾值Ct。數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 人RAGE、TGF-β1、CTGF、MMP-9、β-actin基因引物序列

1.2.7 Western blot測(cè)定細(xì)胞RAGE、TGF-β1、CTGF、NF-κB P65及p-NF-κB P65蛋白表達(dá)水平:細(xì)胞同步化18 h后干預(yù)48或1.5 h，BCA法定量蛋白濃度。10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)法恒流轉(zhuǎn)膜1 h，室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h，辣根過氧化物酶-化學(xué)發(fā)光法顯影，Quantity One成像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析吸光度值，以β-actin為內(nèi)參照，以吸光度比值表示表達(dá)量(目的蛋白條帶/內(nèi)參蛋白條帶)。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吡哆胺對(duì)HK-2細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組相比，AngⅡ組細(xì)胞存活率下降(P<0.01)；干預(yù)24或48 h后，T、P0.1、P1及TP組細(xì)胞存活率較AngⅡ組均上升(P<0.05或P<0.01)；吡哆胺各組中，P10組較AngⅡ組細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，P0.01組與AngⅡ組無明顯差異，故選擇1和0.1 mmol/L兩個(gè)吡哆胺濃度繼續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

*P<0.01 compared with the control group;#P<0.05 compared with the AngⅡ group;##P<0.01 compared with the AngⅡ group;▲P<0.01 compared with the TP group圖1 各組細(xì)胞存活率Fig 1 The cells viability of HK-2 cells

2.2 吡哆胺對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2016年，我國教育部頒布了《中國高等教育系列質(zhì)量報(bào)告》，其中顯示國內(nèi)高等教育“硬件”建設(shè)數(shù)量正在呈現(xiàn)井噴式增長(zhǎng)發(fā)展趨勢(shì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全國固定資產(chǎn)也已經(jīng)全面增加42.15%左右，在教學(xué)、科研儀器等方面更增幅超過60.22%。這些數(shù)據(jù)也在告訴人們高校教育領(lǐng)域已經(jīng)引入了全新的固定資產(chǎn)管理方式，它基本實(shí)現(xiàn)了對(duì)校內(nèi)固定資產(chǎn)管理的管理理念與系統(tǒng)功能數(shù)據(jù)的優(yōu)化，值得期待。

干預(yù)細(xì)胞24 h后，AngⅡ組較對(duì)照組早期凋亡率上升(P<0.01)；與AngⅡ組相比，T、P0.1、P1和TP組早期凋亡率均下降(P<0.01)。其中，P0.1組和P1組早期凋亡率低于T組(均P<0.01)，且P1組較P0.1組更低(P<0.05)；TP組早期凋亡率顯著低于T組、P1組(均P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.01 compared with the AngⅡgroup；△P<0.01 compared with the T group；★P<0.05 compared with the P1 group；▲P<0.01 compared with the TP group

圖2吡哆胺對(duì)HK-2細(xì)胞早期凋亡的影響
Fig2EffectofpyridoxamineonHK-2cellsearlyapoptosis

2.3 吡哆胺對(duì)HK-2細(xì)胞ROS生成的影響

干預(yù)細(xì)胞24 h后，AngⅡ組細(xì)胞ROS生成較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；T、P0.1、P1、TP和DPI組ROS水平較AngⅡ組均降低(P<0.01)。其中P0.1組(P<0.05)、P1組(P<0.01)ROS水平低于T組；P1組低于P0.1組(P<0.01)；TP組ROS水平低于T組及P1組(P<0.01)(表2)。

2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液AGEs濃度

干預(yù)細(xì)胞24 h后，AngⅡ組細(xì)胞上清液AGEs濃度較對(duì)照組升高(P<0.01)； T、P0.1、P1、TP及DPI組較AngⅡ組AGEs濃度均降低(P<0.01)。P1組AGEs濃度低于T組(P<0.01)及P0.1組(P<0.05)； TP組低于T組及P1組(P<0.01)(表2)。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RAGE、TGF-β1、CTGF、MMP-9mRNA表達(dá)水平

干預(yù)細(xì)胞24 h，與對(duì)照組比較，AngⅡ組RAGE、TGF-β1、CTGF和MMP-9 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；T、P0.1、P1、TP、DPI和PDTC組與AngⅡ組相比各基因mRNA表達(dá)均降低(P<0.01)。其中， P1組(均P<0.01)，P0.1組(P<0.05或P<0.01)各基因mRNA表達(dá)水平低于T組； P1組低于P0.1組(P<0.05或P<0.01)； TP組低于T、P1組(P<0.01)(表3)

表2 各組細(xì)胞ROS生成和細(xì)胞上清液晚期糖基化終末產(chǎn)物濃度

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.01 compared with the AngⅡgroup；△P<0.05,△△P<0.01compared with the T group；★P<0.01 compared with the P1 group；▲P<0.01 compared with the TP group.

。

表3 各組細(xì)胞RAGE、TGF-β1、CTGF、MMP-9 mRNA表達(dá)相對(duì)量Table 4 The RAGE, TGF-β1, CTGF, MMP-9 mRNA expression in HK-2 cells(±s，2-△△Ct，n=3)

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.01 compared with the AngⅡgroup；△P<0.05，△△P<0.01compared with the T group；★P<0.05，★★P<0.01 compared with the P1 group；▲P<0.01 compared with the TP group.

2.6Westernblot檢測(cè)RAGE、TGF-β1、CTGF、NF-κBP65及p-NF-κBP65蛋白表達(dá)水平

干預(yù)細(xì)胞48或1.5 h后，AngⅡ組RAGE、TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)及NF-κB P65相對(duì)磷酸化水平較對(duì)照組增加(均P<0.01)；與AngⅡ組相比，T、P0.1、P1、TP、DPI及PDTC組較AngⅡ組各蛋白表達(dá)及NF-κB P65磷酸化水平均下調(diào)(P<0.01)。其中，P1、TP組均低于T組(P<0.01)；P0.1組TGF-β1、CTGF表達(dá)水平低于T組(P<0.01)；P1組RAGE、CTGF表達(dá)及NF-κB P65磷酸化水平低于P0.1組(P<0.01)(圖3，4)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ干預(yù)HK-2細(xì)胞后，產(chǎn)生了降低細(xì)胞存活率、促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡及上調(diào)纖維化因子表達(dá)的效應(yīng)。目前認(rèn)為， AngⅡ結(jié)合AT1受體后，一方面可活化NADPH氧化酶，使ROS生成增加[6]，ROS又可進(jìn)一步促進(jìn)AGEs的生成和RAGE的表達(dá)[7]， AGEs- RAGE可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并通過激活Smad、ERK/P38 MAPK等信號(hào)通路產(chǎn)生上調(diào)TGF-β1及CTGF的效應(yīng)[8]。本研究引入NADPH氧化酶的抑制劑DPI干預(yù)HK-2細(xì)胞，結(jié)果顯示DPI減少由NADPH氧化酶途徑導(dǎo)致的ROS生成增加，下調(diào)AGEs-RAGE水平，同時(shí)使纖維化分子TGF-β1、CTGF、MMP-9表達(dá)減少，提示AngⅡ?qū)K-2細(xì)胞凋亡與纖維化分子表達(dá)的影響與ROS生成及AGEs-RAGE的激活有關(guān)。另一方面，AngⅡ可促使NF-κB P65亞基入核并發(fā)生磷酸化，激活炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)而參與纖維化的發(fā)生，NF-κB抑制劑可取消這一效應(yīng)[9]，在本實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)。

*P<0.01 compared with the control group； #P<0.01 compared with the AngⅡgroup；△P<0.01 compared with the T group；★P<0.01 compared with the P1 group；▲P<0.01 compared with the TP group圖3 各組細(xì)胞RAGE、TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)相對(duì)量Fig 3 RAGE, TGF-β1, CTGF protein expression in HK-2 cells

*P<0.01 compared with the control group； #P<0.01 compared with the AngⅡgroup；△P<0.01 compared with the T group；★P<0.01 compared with the P1 group；▲P<0.01 compared with the TP group圖4 各組細(xì)胞NF-κB P65及磷酸化NF-κBP65表達(dá)水平Fig 4 NF-κB P65 and p- NF-κB P65 protein expression of HK-2 cells by Western blot

研究顯示，1和0.1 mmol/L的吡哆胺均抑制HK-2細(xì)胞早期凋亡并下調(diào)纖維化分子的表達(dá)，高劑量較低劑量的作用更為顯著。目前認(rèn)為，吡哆胺作為一種親核試劑，可捕捉AGEs的前體并抑制糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的生成，發(fā)揮強(qiáng)力抑制AGEs的作用。吡哆胺還可直接清除ROS，減輕氧化應(yīng)激；其獨(dú)特的螯合金屬離子效應(yīng)(主要作用于Cu2+，Zn2+)又加強(qiáng)了其抗氧化的作用[10]。本研究中，吡哆胺還顯著下調(diào)了AngⅡ 作用下的HK-2細(xì)胞NF-κB P65磷酸化水平，且此效應(yīng)能被NF-κB抑制劑PDTC拮抗，提示吡哆胺可能通過影響NF-κB的活性對(duì)細(xì)胞凋亡及纖維化分子的表達(dá)產(chǎn)生作用。這與前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中吡哆胺下調(diào)自發(fā)性高血壓大鼠腎組織NF-κB P65表達(dá)的結(jié)果具有一致性[3]，同時(shí)也提供了吡哆胺作用機(jī)制的體外證據(jù)。

相較之下，替米沙坦的效應(yīng)在一定程度上依賴血流動(dòng)力學(xué)及機(jī)體內(nèi)環(huán)境，其在阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合的同時(shí)可能導(dǎo)致局部AngⅡ的累積，從而限制了其體外效應(yīng)的發(fā)揮。因此吡哆胺較替米沙坦的顯著效應(yīng)可能與其拮抗AGEs-RAGE的作用更為直接且作用路徑短，以及其卓越的抗氧化作用有關(guān)。合用組顯示出優(yōu)于單用替米沙坦及優(yōu)于或不亞于單用吡哆胺的效應(yīng)，提示二者合用可能發(fā)揮正向疊加的腎臟保護(hù)作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，吡哆胺可能通過減少AGEs-RAGE激活、改善氧化應(yīng)激以及下調(diào)NF-κB P65磷酸化水平，從而抑制AngⅡ作用下的HK-2細(xì)胞早期凋亡并下調(diào)其纖維化分子的表達(dá)。本研究為吡哆胺體外發(fā)揮腎臟保護(hù)作用提供了一定的理論依據(jù)，提示合用吡哆胺和替米沙坦在高血壓腎損害治療中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] Rodríguez-Iturbe B, García García G. The Role of Tubulointerstitial Inflammation in the Progression of Chronic Renal Failure[J]. Nephron Clin Pract, 2010, 116: 81- 88.

[2] 林書典，周巧玲，詹鋒. 福辛普利和纈沙坦抑制AngII誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞Klotho基因表達(dá)下調(diào)[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2011, 31: 25- 31.

[3] Zhu P, Lin H, Sun C,etal. Synergistic effects of telmisartan and pyridoxamine on early renal damage in spontaneously hypertensive rats[J]. Mol Med Reports, 2012, 5: 655- 662.

[4] 林虹,朱鵬立.晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體在原發(fā)性高血壓中的作用機(jī)制[J].國際老年醫(yī)學(xué)雜志,2010, 31: 165- 170.

[5] 許傳文，徐艷梅. 替米沙坦延緩糖尿病大鼠腎病的發(fā)生發(fā)展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012, 32: 577- 578.

[6] Nguyen Dinh Cat A, Montezano AC, Burger D,etal. Angiotensin II, NADPH Oxidase, and Redox Signaling in the Vasculature[J]. Antioxid Redox Signal, 2013,19: 1110- 1120.

[7] Yao D, Brownlee M. Hyperglycemia-induced reactive oxygen species increase expression of the receptor for advanced glycation end products (RAGE) and RAGE ligands[J]. Diabetes, 2010, 59: 249- 255.

[8] Ishibashi Y, Matsui T, Takeuchi M,etal. Beneficial effects of metformin and irbesartan on advanced glycation end products (AGEs)-RAGE-induced proximal tubular cell injury[J]. Pharmacol Res, 2012, 65: 297- 302.

[9] Li XC, Zhuo JL. Nuclear factor-κB as a hormonal intracellular signaling molecule:focus on angiotensin II-induced cardiovascular and renal injury[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2008, 17: 37- 43.

[10] Ahmad S, Shahab U, Baig MH,etal. Inhibitory effect of metformin and pyridoxamine in the formation of early, intermediate and advanced glycation end-products[J]. PLoS One, 2013, 8:e72128. doi: 10.1371/journal.pone.0072128.

Effect of pyridoxamine on apoptosis and fibrogenicfactors expression in human proximal tubular epithelial cell line HK-2

YUAN Yin, ZHU Peng-li*, LIN Fan, YU Hui-zhen

(Dept. of Geriatric Medicine, Fujian Provincial Hospital, Fujian Provincial Institute of Clinical Geriatrics,the Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

ObjectiveTo investigate the effect and the mechanism of pyridoxamine on apoptosis and fibrogenic factors expression in HK-2 cells.MethodsCells were divided into groups as follows: control, AngⅡ(10-6mol/L), AngⅡ+ T(10-5mol/L), AngⅡ+ P(0.01,0.1,1,10 mmol/L), AngⅡ+ T+P(1 mmol/L). Cell viability was evaluated by MTT. Cell apoptosis was detected by AnnexinV-FITC/PI assay. Intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by flow cytometry. AGEs level in cellular supernatant were determined by ELISA. The real-time PCR was applied for the mRNA expression ofRAGE,TGF-β1,CTGFandMMP-9. The RAGE, TGF-β1, CTGF and p-NF-κB P65 expression were analyzed by Western blot.ResultsCompared with AngⅡ,pyridoxamine and telmisartan increased cell viability, inhibited cell apoptosis, decreased intercellular ROS level, and lowered the AGEs level in cell culture supernatant(allP<0.01). The mRNA and protein expression of RAGE, TGF-β1,CTGF, MMP-9 and NF-κB P65 phosphorylation were down-regulated respectively(allP<0.01). These effects were more pronounced in pyridoxamine groups than telmisartan group(P<0.05 orP<0.01)while the combination group exhibited more significant effects than the single use of telmisartan(allP<0.01).ConclusionsPyridoxamine may inhibit cell apoptosis and down-regulate fibrogenic factors expression through AGEs-RAGE inhibition, oxidative stress alleviation and NF-κB inactivation.

pyridoxamine; angiotensin; advanced glycation end products; apoptosis; fibrosis

2013- 10- 22

2014- 01- 13

福建省自然科學(xué)基金(2010J01127，2011J01137)

*通信作者(correspondingauthor)： zpl7755@gmail.com

1001-6325(2014)08-1059-06

R 977.2；R329.2；R692.6

A