孫立輝，王大巍，樊毅

(遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院普外二科，遼寧 錦州 121000)

腹腔內(nèi)微量游離癌細胞或微小癌灶的微轉(zhuǎn)移是導致結(jié)直腸癌患者術(shù)后腹膜播散、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因，嚴重影響了結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，及早的發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移成為后續(xù)治療、延長生存期的關(guān)鍵。CK20 在以腺癌為常見的結(jié)直腸癌中高表達，具有嚴格的上皮組織特異性，在癌變的上皮組織以及轉(zhuǎn)移灶中均有表達，而在正常血、淋巴結(jié)及骨髓中均為陰性［1-2］。通過FACTT 聯(lián)合檢測外周血和腹水中CK20 水平，提高循環(huán)腫瘤細胞的檢出率，對結(jié)直腸癌微轉(zhuǎn)移具有一定的臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 我院2012 年11 月至2014 年1 月收治的結(jié)直腸癌病人56 例，男性32 例，女性24例，年齡55～73 歲，中位年齡(57 ±6.6)歲。術(shù)前均未行放、化療，術(shù)前經(jīng)腸鏡活檢病理回報支持診斷，其中直腸癌36 例，結(jié)腸癌20 例;高分化腺癌27 例，中分化腺癌17 例，低分化腺癌12 例。TNM 分期:I 期10 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期8 例，術(shù)后均行6 療程的規(guī)范FOLFOX4 方案化療。

1.2 標本收集 術(shù)前1 d 采取清晨空腹靜脈血5 mL，去除前2 mL 防止表皮細胞污染，F(xiàn)ACTT 法備檢。術(shù)中無瘤接觸情況下注入生理鹽水200 mL，輕輕混合后吸出150～200 mL，若已有腹水直接吸出于4 ℃，1 500 r/min，離心10 min，收集細胞沉淀，保存于-70 ℃冰箱待提取腹腔沖洗液細胞總RNA。

1.3 標本檢測 FACTT 方法:取96 孔板一塊，每孔加60 μL 捕獲抗體4 ℃過夜.加10 g/L 酪蛋白封閉液，22 ℃1 h，加20 μL 待檢抗原22 ℃孵育1 h。加20 μL 稀釋的生物素化檢測抗體(120 mg/L)22 ℃孵育1 h。加5 mg/L 鏈親和素22 ℃孵育1 h。加500 mg/L 生物素化DNA 22 ℃孵育1 h。洗板液PBST (含1 mL/L Tween20 的PBS)洗板6次，在每次結(jié)合孵育后。洗板后，每孔加20 μL 反應(yīng)混合液，組成:60U T7RNA 聚合酶(ambion)，1.25 μmol NTP，XT7 緩沖液。37 ℃孵育3 h。加入RNase 抑制劑，加20 mL RiboGreen (1∶200 稀釋)。在熒光光譜儀上測量(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長35 nm);ELISA 與FCM 按說明書進行。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包，率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

56 例結(jié)直腸癌患者中，無論是外周血或是腹水中，F(xiàn)ACTT 方法對結(jié)直腸腫瘤患者的CK20 陽性檢出率明顯高于常規(guī)的ELISA 和FCM 方法(P ＜0.05)，并且在術(shù)后隨訪證實的外周血聯(lián)合腹水的FACTT-T7RNA 的陽性率達到73.21% (41/56)，較單獨的方法進行檢測具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01);檢測出的CK20 陽性檢測結(jié)果表明外周血與腹水中癌細胞的檢出與結(jié)直腸癌的TNM 分期、分化程度相關(guān)［3］，隨著腫瘤分期的提高，CK20 檢出率越高，分化較差的腫瘤細胞，CK20 高表達，具體情況見表1 和表2。

表1 外周血中CK20 的陽性表達與腫瘤的關(guān)系

表2 腹水中CK20 的陽性表達與腫瘤的關(guān)系

3 討 論

盡管結(jié)直腸癌的綜合治療手段取得了很大的進步，但臨床上未發(fā)生明顯轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌術(shù)后也有30%的患者2 年內(nèi)復發(fā)［4］，提示即使臨床分期為早期的結(jié)直腸癌患者在接受治療時，已經(jīng)發(fā)生了目前常規(guī)的病理學檢查所不能發(fā)現(xiàn)的遠處轉(zhuǎn)移，因此，探討結(jié)直腸癌早期敏感指標的篩選成為研究的熱點。

FACTT-T7RNA 方法是ZHANG 等［5］建立的一種檢測血清蛋白質(zhì)及基因蛋白的新技術(shù)，用來檢測結(jié)直腸癌腫瘤細胞，就是通過特異性的單抗將腫瘤細胞表面的特異性腫瘤抗原同生物素化的DNA 連接起來，具有等溫、成線性定量的特點，可進行實時熒光定量分析，單位細胞數(shù)陽性率高，擴增和檢測可以同步進行，避免假陽性率發(fā)生，檢測快速，易于操作。朱自滿等［6］成功應(yīng)用FACTT 建立了檢測人CEA 的方法，結(jié)果表明其檢測敏感度較ELISA 增高125 倍，較RT-PCR 技術(shù)增高近30倍。CK20 在上皮源性惡性腫瘤細胞中呈高表達［7-8］，且在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移擴散過程中保持相對穩(wěn)定。腹腔灌洗液中游離的RNA 易被降解，若檢測到CK20 基因，則意味著存在表達該基因的腫瘤細胞，因此CK20 作為結(jié)直腸癌微轉(zhuǎn)移的檢測是可信的，是檢測結(jié)直腸癌患者脫落腫瘤細胞存在的重要依據(jù)。

研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ACTT 法檢測腫瘤患者外周血及腹水中CK20 基因表達陽性率分別為57.14 和30.36，較常規(guī)檢測手段檢出率明顯高，單純對照ELISA、FCM 的檢測，檢出敏感性顯著提高，差異具統(tǒng)計學意義。在腫瘤的TNM 分期中，在Ⅲ、Ⅳ腫瘤的術(shù)前評估轉(zhuǎn)移的患者外周血及腹水中，F(xiàn)ACTT 方法檢測CK20 的陽性率較高，提示晚期腫瘤患者的微轉(zhuǎn)移高表達;本研究可以看出，腫瘤的分化程度越高脫落的幾率較大，本組病例高分化腫瘤無論在外周血或腹水中，檢出率均較高，Koutarou Maeda 等［9］研究證實高分化腺癌較中、低分化腺癌脫落的細胞多，有統(tǒng)計學差異，而聯(lián)合的FACTT 檢測，CK20 陽性率高達73.21%，表現(xiàn)出與腫瘤分期及分化程度高度一致的結(jié)果，避免了單純的外周血或腹水檢測的假陰性率，可作為臨床篩選的檢測手段。

本組患者常規(guī)術(shù)后復查CT，以發(fā)現(xiàn)腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫大為計數(shù)標準，F(xiàn)ACTT 聯(lián)合檢測的CK20陽性例數(shù)達到41 例(外周血30 例，腹水11 例)，其中在外周血術(shù)前FACTT 檢測的32 例陽性，2 例患者術(shù)后無腫瘤轉(zhuǎn)移表現(xiàn)，均為Ⅰ期低分化腺癌;腹水的FACTT 檢測中術(shù)后無腫瘤轉(zhuǎn)移表現(xiàn)6 例，其中Ⅰ期4 例，低分化腺癌3 例，中分化粘液腺癌1 例，Ⅱ期2 例，均為低分化腺癌。術(shù)前聯(lián)合檢測證實的CK20 陽性患者中共8 例術(shù)后未出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，例數(shù)較少且不具備獨立因素，無統(tǒng)計學意義，考慮與腫瘤的分期較早，低分化程度相關(guān)。Kodera等［10］報道腹腔沖洗液中CK20 水平可能是結(jié)直腸的獨立預(yù)后因素，本研究結(jié)果也看到如此傾向，手術(shù)后轉(zhuǎn)移的病例11 例，其CK20 水平在第一次手術(shù)時腹水檢測為陽性，提示腹腔沖洗液中CK20 的水平異常是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素。與術(shù)后無瘤生存率密切相關(guān)，并有顯著性差異。但是否是結(jié)直腸癌獨立預(yù)后因素，有待于更長期隨訪結(jié)果的獲得后進行分析。

早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移并予以合理的治療，及時阻斷腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移是提高生存率的關(guān)鍵，利用FACTT 方法的外周血和腹水的CK20 聯(lián)合檢測，對腫瘤患者的微轉(zhuǎn)移對腫瘤的分期治療復發(fā)及預(yù)后都有重要意義。

［1］Paterlini Brechot P，Benali N L.Circulating tumor cells (CTC)detection:Clinical impact and future directions ［J］.Cancer Lett，2007，253 (2):180-204.

［2］Yong Liu，Hai-Xing Ju，Jian-Guo Feng，et a1.Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of colorectal cancer patients without distant organ metastases ［J］.Cellular Oncology，2013，36 (1):1346-1348.

［3］盛新華，高春芳，季錫清，等.結(jié)腸癌與直腸癌根治術(shù)后復發(fā)的比較研究［J］.中華胃腸外科雜志，2010，13 (6):409-412.

［4］王遠鶴，周進，高余佳，等.結(jié)直腸癌根治性手術(shù)后復發(fā)時間與生存時間的相關(guān)性分析［J］.中國癌癥雜志，2013，23 (10):841-844.

［5］Zhang H，Cheng X，Richter M，et al.A sensitive and high-throughout assay to detect low-abund-ance proteins in serum［J］.Nat Med，2006，12 (4):473-477.

［6］朱自滿，李世擁，安萍，等.T7 RNA 聚合酶催化的熒光擴增技術(shù)檢測人CEA ［J］.世界華人消化雜志，2011，15(27):2927-2930.

［7］劉勇，馮建國，錢俊，等.早中期結(jié)直腸癌患者外周血鳥苷酸環(huán)化酶mRNA 和細胞角蛋白20 mRNA 檢測及預(yù)后分析［J］.中華胃腸外科雜志，2013，16 (4):342-344.

［8］沈燾，李云峰，李強.CK20 與結(jié)直腸癌外周血微轉(zhuǎn)移［J］.胃腸病學，2011，16 (10):92-93.

［9］Koutarou Maeda，Morito Maruta.Irrigation Volume Determines the Efficacy of“Rectal Washout”［J］.Dis Colon Rectum，2004，4 (7):1706-1709.

［10］Ito S，Kodera Y，Nakanishl H，et a1.Prospective validation of quantitative CK20 detection in peritoneal washes in colorectal cancer patients ［J］.Br J Cancer，2012，86 (7):846-852.