于 軍，鐵 茹，趙 鴿，張學策，陳寶瑩

(1西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中心實驗室，西安 710038;2第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學教學實驗中心;3西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科;4第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院放射科;*通訊作者，E-mail:chenby128@163.com)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型［1］，而遠端轉移是NSCLC患者的主要死亡原因。受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)在NSCLC 的轉移過程中發(fā)揮重要的作用［2］。EPH是RTKs中最大的一個亞家族，分為EPHA受體1-10(EPHA1-A10)和EPHB受體1-6(EPHB1-B6)。EPHB6受體與其配體Ephrin相互作用。當與其配體Ephrin相互作用后，EPH受體調控一系列的細胞生物學行為，包括細胞與細胞的相互作用、細胞遷移等，EPHB6缺失與晚期的NSCLC和癌癥的進展密切相關［3，4］。DNA 分子中發(fā)生堿基的替換、增添和缺失而引起的基因結構的改變，即基因突變。腫瘤的發(fā)生是一個從突變的積累到選擇進化，再到克隆起源的過程。雖然了解克隆的選擇過程比較困難，但分析基因突變和腫瘤發(fā)生的關聯(lián)將非常有助于研究細胞惡變的分子機制。借助于技術上的進步，近年來，科學家試圖通過高通量基因測序的方法，篩查與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關的基因突變。鑒于其重要的生物學功能，EPHB6成為此類研究中重要的篩查基因之一。本研究通過測序篩查EPHB6編碼區(qū)的序列，并通過生物信息學分析，結合體內外實驗評價其功能性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原發(fā)的腫瘤標本和癌旁的正常組織手術取自80例NSCLC患者(標本來自2000-2013年第四軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院胸外科手術)，組織采用液氮速凍，并保存于液氮之中。對于腫瘤標本行組織學鑒定，只有活檢顯示腫瘤細胞多于70%的組織才用于后續(xù)分析。癌旁正常組織也采用組織學檢測鑒定。所有患者都簽署知情同意書，本研究得到西安醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPHB6基因測序 采用DNAzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)抽提基因組 DNA。用 Primer 3軟件設計引物，用于PCR擴增400-800 bp的片段，涵蓋EPHB6完整的編碼區(qū)［5］。雙側的DNA鏈采用PCR引物測序。測序BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI3730xl自動DNA測序儀上完成。測序得到的EPHB6編碼區(qū)序列與參考序列(GenBank accession No.NM_004445)進行比對。

1.2.2 生物信息學分析 生物信息學預測同時采用兩種預測工具，分別是SIFT(Sort Intolerant from Tolerant，http://sift.bii.a-star.edu.sg/)和 Poly-Phen-2(Polymorphism Phenotype，http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)。操作按照預測系統(tǒng)的說明進行。SIFT的預測得分小于0.05，認為是有害突變;PolyPhen-2將突變分為有害、可能有害和無害3類。

2 結果

2.1 NSCLC中頻發(fā)EPHB6突變

本研究通過對EPHB6整個編碼區(qū)的測序，發(fā)現(xiàn)80例NSCLC患者中有3例(3.8%)存在EPHB6的有義突變(R52C，Q498H，915-917del各 1例)，而在3種NSCLC的細胞系A549、HTB56和HTB58中均未檢測到EPHB6的突變。EPHB6編碼區(qū)的結構圖見圖1(見第667頁)，R52C和Q498H分別位于Ephrin配體結合結構域和FN3結構域。而缺失突變915-917del，位于EPHB6的酪氨酸激酶催化結構域(Tyrkc)和sterile alpha基序(SAM)之間。與結直腸癌中報道的點突變(D915G和G914V)相毗鄰［6，7］。提示，該區(qū)域可能對于EPHB6的功能具有重要的意義。

2.2 突變可能造成EPHB6功能受損

目前已知的所有的EPHB6的體突變位點，共計26個。從組織病理學分類來看，3個突變位點發(fā)現(xiàn)于神經膠質瘤，5個位點發(fā)現(xiàn)于結直腸癌，9個位點發(fā)現(xiàn)于肺癌(其中R52C、Q498H和915_917del是我們首次篩查得到的)，2個位點發(fā)現(xiàn)于卵巢癌，6個位點發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤，1個位點發(fā)現(xiàn)于胃癌?？梢?，肺癌中頻發(fā)EPHB6突變。從結構域分布上來看，9個突變位點位于TyrKc激酶催化結構域，8個突變位點位于Ephrin配體結合結構域，2個位于FN3結構域，7個位于相鄰結構域的連接處。可見，EPHB6編碼區(qū)的各個部位都可能發(fā)生突變。由于EPHB6基因的高度保守性，提示EPHB6突變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要的功能性作用。

SIFT與Polyphen是比較權威的基因突變預測分析系統(tǒng)，研究者可以通過在線的方式對已知的突變位點進行功能預測。SIFT將分值小于0.05的突變界定為有害突變，Polyphen-2將突變分為三類:“probably damaging”、“possibly damaging”和“benign。SIFT與 Polyphen對于目前所有已知的EPHB6體突變預測的結果見表1。其中，SIFT預測有害突變11個，Polyphen-2預測有害突變15個，SIFT和Polyphen-2同時預測有害的突變8個，分別為:A685T(神經膠質瘤)、D345N(結直腸癌)、A203D(肺癌)、R52C(肺癌)、P728H(肺癌)、P728S(卵巢癌)、L21F(卵巢癌)、R704W(黑色素瘤)。

3 討論

本研究中我們首次在NSCLC中鑒定得到EPHB6的新的體突變位點R52C、Q498H和915-917del，證明NSCLC中頻發(fā)EPHB6突變。通過生物信息學分析的方法，預測了目前已知的EPHB6突變的功能，為下一步的功能學實驗奠定了基礎。

EPH作為受體型酪氨酸蛋白激酶中最大的一個亞家族，其突變在腫瘤當中的發(fā)生比較頻繁。一項大樣本的測序研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中有10種EPH基因發(fā)生了突變［8］。由于EPH相關細胞信號網絡的復雜性，對于EPH突變的功能性作用及其后果還知之甚少［9］。EPHB6 的體突變位點在肺癌［8］、結直腸癌［6，7］、卵巢癌［10］和神經膠質瘤［7］中以往都有報道，但突變的功能不明。

本研究篩查了80例NSCLC患者和3例NSCLC細胞系，首次發(fā)現(xiàn)3個EPHB6的未報道過的突變位點。其中，缺失突變del915-917位于酪氨酸激酶結構域與SAM結構域之間。此區(qū)域最近在結直腸癌中也報道有體突變發(fā)生［6，7］。提示，此區(qū)域可能與腫瘤密切相關。

表1 發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織的EPHB6(NM_004445和NP_004436)的所有有義體突變Table 1 All somatic mutations of EPHB6(NM_004445和NP_004436)found in tumor tissues

本研究采用的SIFT與Polyphen是比較權威的基因突變預測分析系統(tǒng)，研究者可以通過在線的方式對已知的突變位點進行功能預測。但是，這兩個系統(tǒng)僅能預測點突變位點，對于缺失突變，例如本研究篩查到的915_917del不能預測。鑒于目前已知的大多數(shù)EPHB6突變均為點突變，我們對這些突變位點分別采用SIFT與Polyphen-2進行了預測分析。本研究顯示，肺癌當中可能的EPHB6有害突變較多，且包括本研究新篩查到的R52C。其確切的生物學效應還需要功能性實驗的進一步證實。

推測EPHB6突變不但造成EPHB6原有的腫瘤轉移抑制效應消失，更重要的是其突變體具有促發(fā)腫瘤轉移的作用。其中一種可能的機制為突變體通過“dominant negative”的方式對野生型EPHB6產生抑制效應。另外，突變體還可能激活促轉移的信號通路及其網絡。但這需要進一步的實驗驗證。

在腫瘤當中，EPHB6既存在“質”變，又存在“量”變。我們以往報道EPHB6存在表觀遺傳學調控，即“量”變，EPHB6在NSCLC中具有甲基化沉默現(xiàn)象，即其啟動子區(qū)高甲基化造成其表達水平降低，并且EPHB6的低表達與腫瘤的轉移密切相關。本研究證實EPHB6突變促發(fā)NSCLC轉移，則表明EPHB6存在遺傳學調控，造成其“質”變，即產生結構和功能異常的蛋白。抓住“質”和“量”這兩條線，將有利于闡明EPHB6與NSCLC轉移的功能性聯(lián)系，為NSCLC的轉移尋找新的突破點。

總之，NSCLC中多發(fā)EPHB6突變，并且EPHB6突變會導致NSCLC細胞產生利于遷移的表型。這可能歸因于突變導致的EPHB6原有抗轉移功能的缺失，也可能是突變體具有新的促轉移功能。其確切機制還有待于進一步研究。

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