史紅陽(yáng)，李滿祥，劉 昀，方 萍，和 平，張德信

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全［1］。其具體的病理機(jī)制包括炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失衡，氧化反應(yīng)與抗氧化反應(yīng)的失衡，進(jìn)而導(dǎo)致了一系列的病理改變［2］。盡管有多項(xiàng)研究及臨床試驗(yàn)，但是目前尚無(wú)有效的干預(yù)措施，ALI死亡率極高［3］。因此急需尋找有效的治療藥物或者新的方法治療急性肺損傷。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)是人體所必需的一種omega－3多不飽和脂肪酸，來(lái)源于魚油和微藻油，對(duì)人體生理功能的正常發(fā)揮及多種疾病的防治有著重要作用。近年來(lái)多項(xiàng)研究證明攝入DHA可發(fā)揮顯著的抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用，能顯著緩解相關(guān)動(dòng)物模型疾?。?－7］。提示DHA對(duì)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有抑制作用。尚未發(fā)現(xiàn)DHA對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的相關(guān)保護(hù)作用。本研究旨在探索DHA是否具有抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)病的作用，并且進(jìn)一步研究DHA改善LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的潛在機(jī)制，以期為急性肺損傷的治療提供新的方式和策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

BALB/c小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。二十二碳六烯酸和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Escherichia coli 055:B5)購(gòu)于美國(guó) Sigma－Aldrich公司。髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、IL-10檢測(cè)試劑盒為R＆D Systems ELISA試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作和實(shí)驗(yàn)分組 6－8周齡BALB/c小鼠(20－25 g)18只隨機(jī)分3組:①對(duì)照組，氣管內(nèi)滴注PBS;②LPS模型組，氣管內(nèi)滴注LPS(100 μg/50μl)，作用6h;③DHA組，連續(xù)給予DHA(500 mg/kg)灌胃連續(xù)預(yù)處理7 d［5］，再氣管內(nèi)滴注 LPS(100μg/50μl)作用6 h;小鼠均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，LPS氣道滴注6 h后處死小鼠。

1.2.2 收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)LPS作用6 h后處死小鼠，利用氣管內(nèi)注射的方式收集BALF，利用0.8 ml預(yù)冷的PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，每只小鼠灌洗3次，BALF的回收率超過(guò)85%。BALF在4℃、1 000×g，離心5 min。分別收集沉淀和上清，BALF上清液在－80℃保存?zhèn)溆?。離心后的細(xì)胞沉淀用PBS重新懸浮，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 肺組織病理學(xué)檢查 取完整的左肺組織在10%中性緩沖福爾馬林溶液中固48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅染色。顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.4 肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6、IL-10 濃度檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液上清中IL-1β、IL-6、IL-10的濃度利用ELISA檢測(cè)，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.5 髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè) 總 MPO活性是中性粒細(xì)胞功能標(biāo)志和啟動(dòng)標(biāo)志，肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞大量聚集可導(dǎo)致MPO活性明顯升高。稱取一定量肺組織，加入5倍體積預(yù)冷的生理鹽水，利用超聲法制作組織勻漿，利用MPO測(cè)定試劑盒在460 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定，從而推算出MPO的活力，反映炎癥的嚴(yán)重程度。

2 結(jié)果

2.1 DHA對(duì)肺組織病理改變的影響

與對(duì)照組相比，氣道內(nèi)滴注LPS6h后，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)大量出血，肺泡間隔水腫增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔不張，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)被完全破壞，而應(yīng)用DHA預(yù)處理后上述病理改變明顯減輕(圖1，見(jiàn)第667 頁(yè))。

2.2 DHA對(duì)小鼠肺組織浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，氣道內(nèi)滴注LPS6h后，BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.01)，與之相伴隨的是肺組織內(nèi)代表中性粒細(xì)胞聚集數(shù)目的MPO活性顯著升高(P＜0.01)，而應(yīng)用DHA連續(xù)預(yù)處理小鼠7 d后，上述改變被顯著抑制。

2.3 DHA對(duì)小鼠肺組織分泌細(xì)胞因子的影響

如圖3所示，氣道內(nèi)滴注LPS6h后，BALF中IL-1β、IL-6的濃度與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)，保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10較對(duì)照組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而應(yīng)用DHA連續(xù)灌胃預(yù)處理小鼠7 d后，BALF中IL-1β、IL-6濃度顯著下降，保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10顯著升高，與LPS模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

當(dāng)機(jī)體遭遇各種炎性刺激(如LPS)后，可釋放各類炎性介質(zhì)(如IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子)，促進(jìn)組織水腫和損傷［8，9］。而藥物干預(yù)上述促炎性細(xì)胞因子的分泌可顯著改善動(dòng)物模型肺損傷［8－10］。本研究中得出了相同的結(jié)論，在LPS干預(yù)組小鼠IL-1β、IL-6顯著升高，同時(shí)BALF中的白細(xì)胞數(shù)目也明顯升高，而DHA預(yù)處理后可顯著抑制白細(xì)胞的浸潤(rùn)及促炎細(xì)胞因子的分泌，提示DHA預(yù)處理可顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷組織病理改變。同時(shí)本研究提示DHA預(yù)處理可顯著減輕LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。

IL-10作為人體內(nèi)重要的抗炎因子，可抑制炎性反應(yīng)，重建抗炎反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的平衡，如抗炎因子分泌量少，不足以對(duì)抗炎性因子所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，則會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)、組織水腫、器官功能損害，并增加患者的死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，因ARDS死亡患者的疾病初期，其肺泡灌洗液中的IL-10濃度較低，推測(cè)IL-10不足可能是導(dǎo)致促炎因子生成增多以及肺內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇的原因之一［11，12］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)吸入IL-10可顯著抑制TNF-α、IL－1β及IL-6的分泌從而對(duì)急性肺損傷動(dòng)物模型發(fā)揮保護(hù)作用［13，14］。在本研究中DHA預(yù)處理顯著促進(jìn)了IL-10的分泌，改善了急性肺損傷。

既往研究發(fā)現(xiàn)DHA可通過(guò)多種機(jī)制抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。Camuesco等［15］研究發(fā)現(xiàn) DHA可通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β的分泌及MPO的活性，顯著改善由5%葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎。Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn) DHA 可通過(guò)抑制 NF-κB 和 TGF-β/Smad信號(hào)通路，減輕膽汁淤積性肝損傷。Tiesset等［16］研究發(fā)現(xiàn)DHA可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)，從而對(duì)銅綠假單胞菌所致的肺部感染發(fā)揮保護(hù)作用。上述多個(gè)體內(nèi)體、外實(shí)驗(yàn)研究表明DHA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多個(gè)器官炎癥反應(yīng)及功能障礙起抑制作用，提示DHA對(duì)上述疾病具有一定的治療作用。本實(shí)驗(yàn)顯示了相同的結(jié)果。DHA通過(guò)抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的分泌，同時(shí)促進(jìn)保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10的分泌，使促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)達(dá)到再平衡，進(jìn)而對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。提示DHA可抑制急性肺損傷小鼠促炎性細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的平衡，從而對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究證明了DHA可促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子IL－10的分泌，抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善肺組織病理變化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的再平衡，從而從多個(gè)方面對(duì)急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展起抑制作用。上述研究結(jié)果提示，DHA具有治療急性肺損傷的潛在價(jià)值，并為其治療提供新的理論依據(jù)。

圖3 DHA對(duì)急性肺損傷小鼠BALF中細(xì)胞因子濃度的影響Figure 3 Effect of DHA on concentrations of cytokines in BALF of LPS-induced acute lung injury mice

［1］Johnson ER，Matthay MA.Acute lung injury:epidemiology，pathogenesis，and treatment［J］.J Aerosol Med Pulm Drug Deliv，2010，23(4):243－252.

［2］Cross L，Matthay M.Biomarkers in acute lung injury:insights into the pathogenesis of acute lung injury［J］.Crit Care Clin，2011，27(2):355－377.

［3］Frank A，Thompson B.Pharmacological treatments for acute respiratory distress syndrome［J］.Curr Opin Crit Care，2010，16(1):62－68.

［4］Chapkin RS，Kim W，Lupton JR，etal.Dietary docosahexaenoic and eicosapentaenoic acid:emerging mediators of inflammation［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2009，81(2/3):187－191.

［5］Chen J，Zeng T，Bi Y，etal.Docosahexaenoic acid(Dha)attenuated paraquat induced lung damage in mice［J］.Inhal Toxicol，2013，25(1):9－16.

［6］Chen WY，Lin SY，Pan HC，etal.Beneficial effect of docosahexaenoic acid on cholestatic liver injury in rats［J］.J Nutr Biochem，2012，23(3):252－264.

［7］Calder PC.N－3 polyunsaturated fatty acids，inflammation，and inflammatory diseases［J］.Am J Clin Nutr，2006，83(6 Suppl):1505S－1519S.

［8］Yan YJ，Li Y，Lou B，etal.Beneficial effects of Apoa-I on LPS-induced acute lung injury and endotoxemia in mice［J］.Life Sci，2006，79(2):210－215.

［9］Pascutti MF，Pitashny M，Nocito AL，etal.Benznidazole，a drug used in Chagas＇disease，ameliorates LPS－induced inflammatory response in mice［J］.Life Sci，2004，76(6):685－697.

［10］Crisafulli C，Mazzon E，Paterniti I，etal.Effects of Liver X receptor agonist treatment on signal transduction pathways in acute lung inflammation［J］.Respir Res，2010，11:19.

［11］Fumeaux T，Pugin J.Role of interleukin－10 in the intracellular sequestration of human leukocyte antigen－DR in monocytes during septic shock［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，166(11):1475－1482.

［12］Donnelly SC，Strieter RM，Reid PT，etal.The association between mortality rates and decreased concentrations of interleukin－10 and interleukin－1 receptor antagonist in the lung fluids of patients with the adult respiratory distress syndrome［J］.Ann Intern Med，1996，125(3):191－196.

［13］Hofstetter C，F(xiàn)londor M，Hoegl S，etal.Interleukin－10 aerosol reduces proinflammatory mediators in bronchoalveolar fluid of endotoxemic rat［J］.Crit Care Med，2005，33(10):2317－2322.

［14］Kobbe P，Lichte P，Schreiber H，etal.Inhalative IL-10 attenuates pulmonary inflammation following hemorrhagic shock without major alterations of the systemic inflammatory response［J］.Mediators Inflamm，2012，2012:512974.

［15］Camuesco D，Comalada M，Concha A，etal.Intestinal anti－inflammatory activity of combined quercitrin and dietary olive oil supplemented with fish oil，rich in EPA and DHA(N－3)polyunsaturated fatty acids，in rats with DSS-induced colitis［J］.Clin Nutr，2006，25(3):466－476.

［16］Tiesset H，Pierre M，Desseyn JL，etal.Dietary(N－3)polyunsaturated fatty acids affect the inetics of pro-and anti-inflammatory responses in mice with Pseudomonas aeruginosa lung infection［J］.J Nutr，2009，139(1):82－89.