李海紅 王秋香 王海琳 劉會玲 祝秉東 王千千 朱曉艷

近些年研究，ENO1基因在宮頸炎、CIN和宮頸癌中表達依次增強，經紫杉醇聯(lián)合卡鉑新輔助化療后比較化療前后的蛋白表達差異，發(fā)現(xiàn)化療ENO1下調。這些提示ENO1可能參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可能會成為一個治療宮頸癌的分子靶點。本實驗擬構建一個真核表達載體ENO1－pBABE－Puro為后期干擾宮頸癌細胞ENO1基因表達，以及表達后與化療藥物相關性研究及ENO1基因表達調控方式及作用做準備，為研發(fā)宮頸癌抗腫瘤藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH 5α 大腸桿菌、pBABE－Puro質粒為本實驗室保存。人癌細胞由本實驗室保存，Trizol購自TAKARA公司，DEPC水、cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，限制性內切酶salⅠ和BamHⅠ購自Ferments公司，DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司，小提質粒提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。引物合成及基因測序由北京華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人總RNA的提取及cDNA的合成 提取RNA前將所用材料用DEPC水浸泡過夜處理，100 ml的PBS加100 μl DEPC水攪拌處理，目的是防止RNA酶的干擾。將長滿整瓶的人癌細胞約1×106個細胞收集到離心管中，然后按照Trizol操作說明提取細胞總RNA，應用紫外分光光度計測定濃度;取提取的RNA 5 μl按cDNA合成試劑盒說明書操作，反轉錄成cDNA用于后續(xù)PCR的模版。

1.2.2 PCR引物設計及合成 根據(jù) GenBank中的烯醇化酶ENO1基因序列設計引物如下:上游5＇CGC GGA TCC ATG TCT ATT CTC AAG3＇，下游 5＇TGT CGA CTG CCC ACA GCT TAC TTG3＇。引物中含有相應酶切位點的序列，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2.3 目的基因的擴增 以上述反轉錄而成的cDNA為模版，應用上述合成的引物進行PCR擴增目的基因ENO1。反應體系為:cDNA模版1 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，5 × PCR Buffer 10 μl，dNTP 5 μl，ddH2O 31 μl，總體系為 50 μl。反應條件是:95℃變性15 s，57℃退火 20 s，72℃延伸30 s，共 40 個循環(huán)，72℃延伸10 min。取100 μl PCR產物按照DNA純化試劑盒說明書操作進行 DNA純化。純化后用 salⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，酶切后按照DNA膠回收試劑盒說明書進行膠回收，然后測DNA密度。

1.2.4 pBABE－Puro 逆轉錄病毒載體的線性化 用salⅠ和BamHⅠ各自單酶切驗證質粒線性化后進行雙酶切，雙酶切后按照膠回收試劑盒說明書膠回收salⅠ和BamHⅠ雙酶切后的 pBABE－Puro質粒，然后檢測DNA濃度。膠回收產物用于后期連接使用。

1.2.5 重組逆轉錄病毒的構建 將膠回收后的ENO1目的基因和pBABE－Puro質粒按分子量3∶1～5∶1的體系，用T4DNA連接酶在16℃水浴鍋中過夜連接。將連接好的重組質粒轉化到感受態(tài)細胞E.coli DH 5α大腸桿菌中，涂在含有氨芐抗生素的瓊脂LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取含有氨芐抗生素生長的陽性克隆菌落，置于液體LB培養(yǎng)基中擴增，提取質粒。

1.2.6 重組載體的酶切鑒定及序列分析 將提取好的重組質粒進行salⅠ和BamHⅠ酶切初步鑒定。然后將帶有重組質粒的菌液送北京華大基因公司測序。

2 結果

2.1 目的基因的擴增、克隆及鑒定

以上述反轉錄合成的cDNA為模版和上海生工生物工程技術有限公司合成的引物進行PCR基因克隆。1%瓊脂糖電泳結果顯示，在約1 305 bp的位置出現(xiàn)目的條帶，與預期目的條帶一致，見圖1。

圖1 PCR產物瓊脂糖電泳圖

2.2 重組逆轉錄病毒載體的構建及鑒定

將構建好的重組質粒轉化到感受態(tài)細胞E.coli DH 5α大腸桿菌中，經氨芐抗生素篩選陽性克隆擴增提取 ENO1－pBABE－Puro 重組質粒，經 salⅠ和 BamHⅠ雙酶切鑒定。1%瓊脂糖電泳結果顯示，ENO1－pBABE－Puro重組質粒經salⅠ和BamHⅠ雙酶切后出現(xiàn)兩條條帶，一條與PCR產物大小一致，一條與pBABEPuro質粒一致。說明ENO1已成功插入pBABE－Puro載體中，見圖2。

圖2 重組質粒 ENO1－pBABE－Puro經salⅠ和BamHⅠ雙酶切電泳圖

2.3 序列測定

將經salⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定為陽性的菌液送往北京華大基因公司測序。測序結果與GenBank中公布的人ENO1基因序列完全一致，見圖3。

圖3 重組質粒ENO1－pBABE－Puro部分測序圖

3 討論

德國生理學家Otto.Warburg早在1924年就提出了Warburg效應的觀點，即惡性腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細胞仍有活躍的糖酵解代謝過程。Warburg效應的提出，是糖酵解代謝過程一度成為腫瘤研究的熱點。特別是近年認為Warburg效應是腫瘤的重要特征之一［1］，而且由于在臨床上正電子發(fā)射斷層顯影(PET)技術利用Warburg效應來診斷、發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的應用，使糖酵解代謝過程在腫瘤中的研究更受矚目。近些年研究探索，通過靶向糖代謝途徑中的一個或多個關鍵酶或其他分子來治療惡性腫瘤的策略備受關注。ENO1是糖酵解途徑的關健酶，它的基因的表達及在細胞中的定位對腫瘤的影響非常重要，因此對它的研究就顯得非常必要。

ENO1 又稱 α－烯醇化酶(α－enolase)、非神經烯醇化 酶 (non－neural enolase)，基 因 位 于 1q36.3－1q 36.2［2］，此基因編碼 α 亞基，還有 2個烯醇化酶基因ENO2(enolase－2)、ENO3(enolase－3)分別編碼 γ、β 2個亞基。α、γ、β這3種亞基以非共價鍵結合形成αα、αβ、αγ、ββ、γγ 5種結構形式，一般 αα 型即 ENO1 存在于絕大多數(shù)組織中;ββ 型即 β－烯醇化酶(β－enolase)幾乎只存在肌肉組織中;γγ型特異性存在于神經元和神經內分泌細胞中，成為神經母細胞瘤及具有神經內分泌作用的小細胞肺癌的腫瘤標志物［3－4］。ENO1基因轉錄物含有2個編碼起始位點翻譯2種蛋白即37 ku 的蛋白 c－myc 啟動子結合蛋白(c－myc promoter binding protein，MBP－1)和48 ku 的 ENO1。ENO1 含有433個氨基酸，這兩個相同的αα亞基每個亞基的相對分子量約47 000;鎂離子是維持ENO1二聚體結構穩(wěn)定性和最大活性的重要輔因子。

長期以來認為ENO1是一個古老、保守、功能單一的蛋白，但最近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)ENO1不僅只是一個糖酵解過程中的關健酶催化磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的轉化，還是一個參與多種生理、病理過程的蛋白［5］，隨細胞的生理、病理、代謝和發(fā)育狀況的不同ENO1基因的表達有明顯差異。而且在細胞的胞核、胞質及包膜中都有表達［6］。ENO1在細胞中不同位置的定位有相對主要的功能。主要定位于胞核中的是ENO1 基因編碼的 MBP－1［7］，它雖然不具有糖酵解酶的活性，但能與c－myc p2啟動子結合，負向調控c－myc的表達［8］。原癌基因 c－myc是控制細胞周期、調節(jié)細胞增殖與分化的一個重要基因，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中c－myc基因產物表達異常促進腫瘤細胞的發(fā)生。Ghosh等［9］通過腺病毒將 MBP－1導入前列腺癌后，可誘導細胞凋亡。MBP－1可抑制胃癌細胞的增值［9］;Ejesk?r［10］將 ENO1 轉染 1q 缺失的成神經細胞后，瘤細胞生長明顯被抑制;Ghosh［11］、Chang 等［12］學者發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中ENO1表達普遍下調，且表達下調者預后差。這些研究證實定位于胞核的MBP－1具有抑制腫瘤細胞生長的作用，如宮頸癌、乳腺癌。但近年研究結果卻與之相反，主要因為定位于胞質中ENO1是作為糖酵解的關健酶存在的，腫瘤細胞由于生長速度快，血供相對不足，腫瘤細胞長期處在缺氧的環(huán)境中，而且由于生長過快，細胞合成、生長所需能量增多。因此定位于胞質中的ENO1在肺癌、結腸癌、胃癌、乙肝病毒相關的肝癌、鼻咽癌、甲狀腺嗜酸細胞瘤和黑色素細胞瘤等腫瘤中表達增高［13－18］，且 ENO1與腫瘤的大小、分化程度、預后差有相關性。其在慢性宮頸炎、CIN和宮頸癌ENO1表達逐漸增強［19］。定位于細胞膜表面的ENO1起著纖溶酶原受體的作用，參與結合、活化、穩(wěn)定纖溶酶原以及腫瘤細胞的侵襲和轉移［20－21］。而且細胞膜上表達的ENO1增高可以增強單核巨噬細胞的侵潤能力，提高穿透基質的能力，還可能通過Notch信號通路控制c－myc癌蛋白的表達，參與腫瘤的形成過程［21］。有相關報道證實，細胞膜上的ENO1基因的表達與惡性腫瘤細胞的轉移呈正相關。

ENO1與宮頸癌的研究國內外極少見，然而仍有相關報道提示，ENO1在宮頸癌中不僅在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌3組病變中ENO1蛋白的表達逐漸增強，且ENO1的表達與患者年齡、腫瘤病理分級及有無淋巴結轉移等臨床病理學特征無明顯差異。但在腫瘤分化中，分化越低，核表達越少，其差異有顯著性。這提示在宮頸癌中分化越低，能調控抑制 c－myc蛋白的MBP－1可能減少了［19］。可見 ENO1基因的表達對宮頸癌有重要作用。但由于ENO1與宮頸癌相關性的研究國內外極少見，因此在宮頸癌中腫瘤細胞是如何調控ENO1在細胞中的分布、作用使正常細胞胞核中多抑癌作用的MBP－1向腫瘤細胞胞核外的ENO1轉化，以及ENO1表達對宮頸癌細胞化療的影響，有待進一步研究。綜上所述，構建一個含有ENO1基因的真核表達載體非常有必要。pBABE－Puro載體是來源于莫洛尼鼠類白血病病毒，性質穩(wěn)定，對細胞毒性小，能夠穩(wěn)定的表達外源目的基因及不影響其正常的功能，而且pBABE－Puro載體有很高的轉染效率，因此廣泛應用于某些蛋白功能的研究。本實驗經過酶切初步鑒定及測序的最終鑒定證實，成功構建了ENO1的真核表達載體ENO1－pBABE－Puro。為研究ENO1在腫瘤中作用和與宮頸癌細胞化療之間的相關性做好準備。ENO1可能成為宮頸癌分子靶向治療的一個靶點。

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