魯亮，張漢群，楊飛月，張赟，羅旻，曹輝

(貴州省人民醫(yī)院腫瘤科，病理科,貴州550002)

孕激素受體(progesterone receptor，PR)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)和人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是評(píng)價(jià)乳腺癌治療效果和判定預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。而Ki-67漸漸成為近年來一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。本文通過對(duì)86例乳腺癌病人的臨床資料進(jìn)行分析，探討Ki-67于乳腺癌各亞型中的表達(dá)及臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集貴州省人民醫(yī)院腫瘤科2011年1月-2012年12月收治的86例乳腺癌患者，篩出滿足下列條件的病例：(1)女性；(2)有手術(shù)指征；(3)術(shù)后病理診斷為乳腺癌；(4)手術(shù)行了腋窩淋巴結(jié)清掃；(5)術(shù)前未行化放療和內(nèi)分泌治療。共86例患者的臨床病理資料(我院病理科出示的病理報(bào)告)?；颊吣挲g20～76歲，中位年齡49歲，年齡≤35歲者9例(10.5%)，>35歲者 77例(89.5%)。 Tis 5例(5.8%)，T1 46 例(53.5%)，T2 29 例(33.7%)，T3 4 例(4.7%)，T4 2例(2.3%)。腋窩淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者36例(41.9%)，無轉(zhuǎn)移者50例(58.1%)。按照第7版AJCC乳腺癌TNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)：0期5例(5.8%)，Ⅰ期24例 (27.9%)，Ⅱ期41例 (47.7%)，Ⅲ期16例(18.6%)。組織學(xué)類型：浸潤性導(dǎo)管癌75例(87.2%)，浸潤性小葉癌6例(7.0%)，導(dǎo)管原位癌5例(5.8%)。

1.2 免疫組化檢測 使用免疫組化二步法進(jìn)行病理診斷。石蠟切片脫蠟后，用蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5 min，置于pH 6.0的枸櫞酸液中，于120℃的高壓鍋中抗原修復(fù)6 min，冷卻至常溫。使用3%H2O2于常溫下溫育5～10 min，為消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，用PBS沖洗3次，每次2 min。分別滴加 Ki-67、PR、ER、HER-2 一抗工作液，于 37 ℃溫育1～2 h。用PBS沖洗3次，每次2 min。滴入試劑 1(Polymer Helper)，37℃溫育 20 min，用 PBS 沖洗3次，每次2 min。滴入試劑2(多聚過氧化物酶抗兔及抗鼠抗體)，常溫溫育20～30 min，用PBS沖洗3次，每次2min。使用DAB顯色劑顯色5～8 min。清水充分沖洗，采用蘇木素復(fù)染，脫水至透明、封片。

1.3 結(jié)果評(píng)定 PR及ER陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞少于5%的細(xì)胞核呈較弱棕黃色或無細(xì)胞核呈棕黃色為陰性，>5%的細(xì)胞核呈棕黃色為陽性。Ki-67陽性定位于細(xì)胞核染色，以視野中出現(xiàn)陽性細(xì)胞所占的比例進(jìn)行計(jì)數(shù)，任意每5個(gè)高倍視野中出現(xiàn)陽性細(xì)胞數(shù)所占比例的平均值為陽性細(xì)胞數(shù)百分比并作為判定依據(jù)。HER-2陽性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃染色為陽性。<10%的細(xì)胞膜呈較弱染色或無細(xì)胞膜染色為(-)；>10%的細(xì)胞膜呈現(xiàn)部分較弱染色為(+)；>10%的細(xì)胞膜完全呈較弱至中等染色為(++)；>10%的細(xì)胞膜呈現(xiàn)全強(qiáng)染色為(+++)。因未對(duì)HER-2(++)的病例行進(jìn)一步FISH檢測，故將結(jié)果(++)及以者下定為陰性，(+++)者定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，資料計(jì)數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

臨床病理特征和Ki-67指數(shù)的關(guān)系:>35歲與≤35歲的患者間Ki-67指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.078)。腫瘤直徑≤2 cm的患者Ki-67指數(shù)低于腫瘤直徑>2 cm患者(P=0.002)。淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移者Ki-67指數(shù)無差異(P=0.214)。病理分期為Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期患者的Ki-67指數(shù)均明顯高于病理分期為0期者(P<0.05)，而Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ期三者間的Ki-67指數(shù)無差異(P>0.05)。PR(-)患者Ki-67指數(shù)明顯高于 PR(+)者(P<0.001)；ER(-)患者 Ki-67 指數(shù)明顯高于 ER(+)患者(P<0.001)；HER-2(+)患者的 Ki-67指數(shù)明顯高于 HER-2(-)者(P=0.011，表1)。

表1 乳腺癌臨床病理特征與Ki-67的關(guān)系

3 討論

Gerdes等于1983年發(fā)現(xiàn)Ki-67，是細(xì)胞增殖中表達(dá)的一種核抗原。Ki-67在細(xì)胞分裂中的S期后期及G2期表達(dá)明顯增加，M期時(shí)達(dá)到高峰，細(xì)胞分裂的后期及末期快速下降；而在S期早期及G1期表達(dá)水平較低，在G0期基本不表達(dá)。對(duì)于Ki-67的這個(gè)顯著特點(diǎn)，被認(rèn)為是能夠有效評(píng)估細(xì)胞增殖的一個(gè)重要指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道，正常乳腺組織和乳腺癌組織中Ki-67的表達(dá)存在明顯差異，正常乳腺組織 Ki-67顯低表達(dá)(<3%)[1，2]。 Fasanella等[3]報(bào)告315例乳腺癌的Ki-67陽性指標(biāo)為36%±14%，與本研究結(jié)果類似。在本項(xiàng)研究中，不同年齡的患者Ki-67之間無差異(P=0.078)。對(duì)于腫瘤大小與Ki-67的關(guān)系，較早報(bào)道兩者呈正相關(guān)[4]，而Inwald等報(bào)道兩者間無關(guān)[5]。該研究顯示腫瘤較大者Ki-67指數(shù)增高(P=0.002)。對(duì)于腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67的關(guān)系，部分研究認(rèn)為，Ki-67和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[6]。Park等報(bào)道兩者無關(guān)[7]，本項(xiàng)研究的結(jié)果顯示，Ki-67指標(biāo)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)(P=0.214)。 Ki-67與病理分期相關(guān)(P=0.001)，進(jìn)一步分析顯示，病理分期為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期Ki-67指數(shù)均明顯高于病理分期為0期者(P<0.05)，而Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期三者間的Ki-67指數(shù)無差異(P>0.05)。結(jié)果提示，Ki-67指標(biāo)主要與腫瘤局部的增殖相關(guān)，并不能反應(yīng)區(qū)域淋巴結(jié)的情況。

關(guān)于Ki-67與ER、PR的關(guān)系，有報(bào)道呈正相關(guān)[8]；也有報(bào)道呈負(fù)相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，ER、PR表達(dá)為陰性者，Ki-67指數(shù)明顯高于ER、PR表達(dá)陽性者(P<0.001)。因ER、PR陽性的乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療有效，預(yù)后比ER、PR陰性的乳腺癌較好，故可以推測Ki-67高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后可能較差。關(guān)于Ki-67和HER-2表達(dá)有報(bào)道呈正相關(guān)[10]，也有呈負(fù)相關(guān)的報(bào)道[11]。本研究顯示HER-2陽性者Ki-67指數(shù)明顯高于HER-2陰性者 (P=0.011)。若HER-2呈過度表達(dá)，患者預(yù)后較差已成定論，由此可以推測Ki-67高表達(dá)的患者預(yù)后較差。

本項(xiàng)研究提示，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，Ki-67和ER、PR、HER-2之間可能存在著某種關(guān)系，Ki-67的高度或高表達(dá)可能是一個(gè)不良預(yù)后因素。目前仍缺乏統(tǒng)一的Ki-67檢測和評(píng)估方案，尚缺乏大樣本的前瞻性研究，現(xiàn)Ki-67不能成為公認(rèn)的乳腺癌預(yù)后指標(biāo)。盡管如此，Ki-67很可能是繼HER-2之后又一個(gè)重要的生物預(yù)后指標(biāo)[12]，將在乳腺癌的預(yù)測預(yù)后和指導(dǎo)治療方面發(fā)揮著重要的作用。

[1]Singhai R,Patil V,Patil A.Status of HER-2/neu receptors and Ki-67 in breast cancer of Indian women[J].Int J Appl Basic Med Res,2011,1(1):15-19.

[2]Agboola AO,Banjo AA,Anunobi CC,et al.Cell Proliferation (KI-67)Expression Is Associated with Poorer Prognosis in Nigerian Compared to British Breast Cancer Women[J].ISRN Oncol,2013:675051.

[3]Fasanella S,Leonardi E,Anunobi CC,et al.Proliferative activity in human breast cancer:Ki-67 automated evaluation and the influence of different Ki-67 equivalent antibodies[J].Diagn Pathol,2011,Suppl 1:S7.

[4]Molino A,Micciolo R,Turazza M,et al.Ki-67 immunostaining in 322 primary breast cancers:associations with clinical and pathological variables and prognosis[J].Int J Cancer,1997,74(4):433-437.

[5]Inwald EC,Klinkhammer-Schalke M,Hofstadter F,et al.Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients:results of a large population-based cohort of a cancer registry[J].Breast Cancer Res Treat,2013,139(2):539-552.

[6]Hlupic L,Jakic-Razumovic J,Bozikov J,et al.Prognostic value of different factors in breast carcinoma[J].Tumori,2004,90(1):112-119.

[7]Park D,Karesen R,Noren T,et al.Ki-67 expression in primary breast carcinomas and their axillary lymph node metastases:clinical implications[J].Virchows Arch,2007,451(1):11-18.

[8]Loehberg CR,Almstedt K,Jud SM,et al.Prognostic relevance of Ki-67 in the primary tumor for survival after a diagnosis of distant metastasis[J].Breast Cancer Res Treat,2013,138(3):899-908.

[9]Bader AA,Tio J,Petru E,et al.T1 breast cancer:identification of patients at low risk of axillary lymph node metastases[J].Breast Cancer Res Treat,2002,76(1):11-17.

[10]Trihia H,Murray S,Price K,et al.Ki-67 expression in breast carcinoma:its association with grading systems,clinical parameters,and other prognostic factors--a surrogate marker? [J].Cancer,2003,97(5):1321-1331.

[11]Nicholson RI,McClelland RA,Finlay P,et al.Relationship between EGF-R,c-erbB-2 protein expression and Ki-67 immunostaining in breast cancer and hormone sensitivity[J].Eur J Cancer,1993,29A(7):1018-1023.

[12]Cuzick J,Dowsett M,Pineda S,et al.Prognostic value of a combined estrogen receptor,progesterone receptor,Ki-67,and human epidermal growth factor receptor 2 immunohistochemical score and comparison with the Genomic Health recurrence score in early breast cancer[J].JClin Oncol,2011,29(32):4273-4278.