劉發(fā)生，夏志楊，盛翔，周燦邦

(東莞仁康醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 東莞523952)

電泳分析是研究和分離異常血紅蛋白的有效方法，是診斷血紅蛋白分子病不可缺少的手段。血紅蛋白電泳作為地中海貧血篩查項(xiàng)目，在日常工作中標(biāo)本多，而紅細(xì)胞洗滌為手工操作，不僅工作量大，而且產(chǎn)生大量需要消毒的實(shí)驗(yàn)廢液。為了減輕工作量，我們以洗滌前后的紅細(xì)胞分別制備血紅蛋白液，同時(shí)進(jìn)行血紅蛋白電泳；還以血漿代替紅細(xì)胞加等量溶血?jiǎng)┖笤谘t蛋白電泳凝膠上電泳，觀察是否出現(xiàn)電泳區(qū)帶，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集本院2013年1月11日至2013年3月16日期間，地中海貧血篩查乙二胺四乙酸二鉀抗凝血標(biāo)本259份，其中靜脈血121份(男性10人，年齡14～43歲，平均31.6歲；女性111人，年齡16～82歲，平均27.4歲)，臍帶血 138份。收集乙二胺四乙酸二鉀抗凝的無(wú)溶血血漿26份，其中靜脈血漿13份(總蛋白59.9～93.9g/L、白蛋白33.5～58.2g/L、 球蛋白 25.8～65.0g/L)， 臍帶血漿 13份(總蛋白 48.1～64.8g/L、白蛋白 27.3～38.7g/L、球蛋白13.3～31.7g/L)。不能當(dāng)天電泳的標(biāo)本置4℃冰箱冷藏保存，時(shí)間不超過1周。

1.2 儀器與試劑 Interlab G26全自動(dòng)蛋白質(zhì)電泳儀，由意大利Interlab公司生產(chǎn)，使用該公司配套生產(chǎn)的堿性血紅蛋白凝膠電泳試劑盒604K。嚴(yán)格按儀器和試劑說(shuō)明書操作。

1.3 方法

1.3.1 洗滌前紅細(xì)胞血紅蛋白電泳 抗凝血標(biāo)本經(jīng)3500r/min 10min后，傾去血漿和上層紅細(xì)胞，留取管底層紅細(xì)胞，吸取管底層紅細(xì)胞50μl，加入450μl溶血?jiǎng)┲?，混勻，靜置5min后加樣上機(jī)進(jìn)行血紅蛋白電泳。

1.3.2 洗滌后紅細(xì)胞血紅蛋白電泳 將上述管底層紅細(xì)胞加2 ml生理鹽水，混勻后3500r/min 5min，吸去上清液后再加2 ml生理鹽水，如此洗3次。吸取管底層紅細(xì)胞50μl，加入450μl溶血?jiǎng)┲?，混勻，靜置5min后加樣上機(jī)進(jìn)行血紅蛋白電泳。

1.3.3 血漿代替紅細(xì)胞電泳 取血漿50μl，加入450μl溶血?jiǎng)┲?，混勻，靜置5min后加樣上機(jī)在血紅蛋白瓊脂糖凝膠上電泳。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 15.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 121份靜脈血標(biāo)本血紅蛋白電泳結(jié)果 (1)紅細(xì)胞洗滌前后電泳圖目視檢查，區(qū)帶數(shù)和位置完全一致，HbA與HbA2光度密掃描結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表1；配對(duì)t檢驗(yàn)，P均＞0.05，說(shuō)明靜脈血紅細(xì)胞洗滌前后電泳結(jié)果的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)有3份標(biāo)本紅細(xì)胞洗滌前檢出HbF(分別為1.0%、0.4%、0.7%)，而洗滌后HbF均為0；另有1份標(biāo)本洗滌前HbF 9.8%，洗滌后HbF 9.4%。也即，少數(shù)靜脈血標(biāo)本未洗滌紅細(xì)胞對(duì)HbF結(jié)果可能有一定影響(≤1.0%)，但不影響結(jié)果的定性判斷。(3)有1份標(biāo)本檢出“快泳帶”，洗滌前42.6%，洗滌后41.3%。

表1 121份靜脈血紅細(xì)胞洗滌前后血紅蛋白電泳結(jié)果

2.2 184份臍帶血標(biāo)本血紅蛋白電泳結(jié)果 (1)紅細(xì)胞洗滌前后電泳圖目視檢查，區(qū)帶數(shù)和位置完全一致，HbA與HbF光度密掃描結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表2；(2)有17份標(biāo)本洗滌前和/或洗滌后檢出HbA2，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析見表3；(3)有11份標(biāo)本檢出“快泳帶”，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析見表4?？梢?，無(wú)論是HbA、HbF，還是 HbA2或者“快泳帶”的配對(duì) t檢驗(yàn)，P＞0.05，說(shuō)明臍帶血紅細(xì)胞洗滌前后電泳結(jié)果的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 184份臍帶血紅細(xì)胞洗滌前后血紅蛋白電泳結(jié)果

表3 17份臍帶血檢出HbA2情況

表4 11份臍帶血檢出快泳帶情況

2.3 血漿代替紅細(xì)胞電泳結(jié)果13份成人血漿和13份臍帶血漿電泳圖目視檢查，在掃描區(qū)域內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)任何區(qū)帶，只在陽(yáng)極海綿條位置有一染色區(qū)帶?？梢姡♂?0倍的血漿在血紅蛋白電泳條件下的電泳圖于掃描區(qū)域內(nèi)不會(huì)呈現(xiàn)區(qū)帶。

2.4 部分標(biāo)本紅細(xì)胞洗滌前后的血紅蛋白電泳圖與血漿代替紅細(xì)胞的電泳圖 見圖1。

圖1 部分標(biāo)本紅細(xì)胞洗滌前后的血紅蛋白電泳圖與血漿代替紅細(xì)胞的電泳圖

3 討論

地中海貧血的診斷遵循由篩查試驗(yàn)(血液學(xué)表型分析)到確診試驗(yàn)(基因型分析)的流程。目前一般把全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白電泳作為地中海貧血的初篩指標(biāo)[1]。與紅細(xì)胞參數(shù)、滲透脆性等地貧篩查方法相比，血紅蛋白電泳不僅可以檢測(cè)HbA、HbF及HhA2含量，將地中海貧血初步分類為α地貧或β地貧，還可篩查出各種異常血紅蛋白，如HbBatr`s、HbH、HbE、HbJ、HbG、HbD、HbK、HbCS等，有助于臨床確診，為進(jìn)一步進(jìn)行基因診斷和遺傳咨詢提供基礎(chǔ)[2，3]。

瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大，近似自由電泳，且對(duì)樣品吸附極微。因此，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好[4]。全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳具有能嚴(yán)格控制電泳條件，自動(dòng)掃描定量，避免人工操作帶來(lái)的技術(shù)誤差，保證各區(qū)帶定量的準(zhǔn)確性，圖譜可長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，目前被很多醫(yī)院用于地中海貧血的篩查，但有報(bào)道，其對(duì)部分HbH及HbBatr`s區(qū)帶不能準(zhǔn)確檢出[5]。

血紅蛋白液的制備方法有四氯化碳法、氯仿法、蒸餾水法等。四氯化碳法制備的血紅蛋白液清晰、穩(wěn)定，但毒性較大。氯仿雖然毒性較小，但能沉淀不穩(wěn)定血紅蛋白而不能用于不穩(wěn)定血紅蛋白的檢查。蒸餾水法簡(jiǎn)便易行，為多數(shù)全自動(dòng)電泳儀試劑盒所采用，本研究用試劑盒也為蒸餾水法，但因未除去膜蛋白，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)注意，且制成的血紅蛋白液不能保存[6]，還有報(bào)道，蒸餾水法對(duì)異常血紅蛋白的檢出率不如四氯化碳法[7]。

為了避免血漿蛋白對(duì)血紅蛋白電泳結(jié)果的影響，一般都要對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌。但是，紅細(xì)胞洗滌為手工勞動(dòng)，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且產(chǎn)生大量需要消毒處理的廢液。本研究結(jié)果表明：即使以血漿代替紅細(xì)胞進(jìn)行電泳，在實(shí)驗(yàn)條件下也不會(huì)出現(xiàn)電泳區(qū)帶。因?yàn)檠t蛋白電泳時(shí)間較血清蛋白電泳時(shí)間長(zhǎng)，血漿蛋白都“跑”過了血紅蛋白電泳圖的掃描區(qū)域。而且，離心后管底紅細(xì)胞層中血漿量很少，其點(diǎn)樣液中的血漿蛋白組分濃度達(dá)不到瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)限(0.54g/L)[8]，因而在血紅蛋白電泳圖掃描區(qū)域內(nèi)看不到血漿蛋白區(qū)帶，紅細(xì)胞洗滌前后血紅蛋白電泳各區(qū)帶掃描結(jié)果的差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們認(rèn)為全血3500r/min 10min離心后管底紅細(xì)胞無(wú)需洗滌，可直接制備血紅蛋白液用于Interlab G26瓊脂糖凝膠電泳。

盡管未洗滌紅細(xì)胞與洗滌紅細(xì)胞的血紅蛋白電泳結(jié)果定性判斷一致，但少數(shù)靜脈血標(biāo)本未洗滌紅細(xì)胞對(duì)HbF結(jié)果可能有一定影響，是否有某些特殊病例的血漿成分會(huì)出現(xiàn)異常區(qū)帶或與血紅蛋白區(qū)帶重疊，有待進(jìn)一步觀察。因此，對(duì)于出現(xiàn)存疑區(qū)帶的標(biāo)本，或臨床與其他實(shí)驗(yàn)提示可能有異常血紅蛋白的標(biāo)本，應(yīng)當(dāng)在洗滌紅細(xì)胞后，以四氯化碳法制備血紅蛋白液進(jìn)行電泳復(fù)檢。

[1]高麗韶,王瑩,張翠梅.認(rèn)識(shí)地中海貧血(上)[M].廣州：廣東人民出版社,2010:99-100.

[2]陳忠領(lǐng),魏新燕,范關(guān)珍,等.911例血紅蛋白電泳結(jié)果分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2006,13(16):2806-2807.

[3]梁廷中.全自動(dòng)血紅蛋白電泳在地中海貧血篩查中的作用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,29(4):417-418.

[4]康熙雄.臨床電泳[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:29-30.

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[6]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].第3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:180.

[7]劉慶峰,何雅軍,黎慶梅,等.兩種不同溶血方法對(duì)Hb電泳分辨率的影響[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2010,17(1):37-38.

[8]Interlab Srl.Alkaline Hemoglobin Electrophoresis procedure for Microgel and Interlab G26[EB/CD].Roma:Interlab Srl,2008,10:9.