周建亮，萬艷芳

(1、東鄉(xiāng)縣疾病預防控制中心檢驗科，江西 東鄉(xiāng)331800；2、東鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院檢驗科，江西 東鄉(xiāng)331800)

沙門菌屬屬于細菌性食物中毒的主要誘發(fā)病原體之一，因此對于食品沙門菌的快速敏感衛(wèi)生檢測十分重要[1]。目前，國內多采用分離培養(yǎng)法進行食品沙門菌檢測，但操作步驟較多，繁瑣且費時。而其他的諸如免疫學方法、各種聚合酶鏈反應法，要么敏感度較差，要么各種聚合酶鏈反應需要特殊儀器設備，應用具有一定局限性。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術作為新型等溫核酸擴增方法，操作簡單，敏感度較高。現對食品衛(wèi)生檢驗中沙門菌屬LAMP檢測方法與分離培養(yǎng)法檢測效果進行比較研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至9月收集的127份食品樣本作為研究對象。其中生鮮肉21份，熟肉制品20份，生水產品20份，非發(fā)酵豆制品17份，冷凍生肉16份，速凍米面制品12份，冰激凌9份，鮮榨果汁6份，生食類蔬菜6份。參考菌株為腸炎沙門菌(ATCC，DSM-14221)。

1.2 方法 參照 《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》標準對收集的127分樣本進行增菌培養(yǎng)。所有樣本均取樣25g加入至裝有BPW 225ml的無菌均質袋中使用拍擊式均質器連續(xù)拍打1～2 min，然后將樣本放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～18h。冷凍產品需在45℃以下15min內解凍。取培養(yǎng)過的食品樣本進行LAMP檢測和分離培養(yǎng)鑒定，兩種檢測方法具體如下。LAMP檢測：分別取1ml食品標本前增菌液在10000r/min下離心2min，棄上清，提取核酸；再取1μl上清液，作為待檢模板DNA。參考中華人民共和國衛(wèi)生部GB 4789.4-2010食品安全國家標準中的《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》進行引物設計，然后對食品標本增菌液DNA進行檢測[2]。 反應體系(25μl)：40μM FIP 1.0μl，40μM BIP 1.0μl，10μM F3 0.5μl，10μM B3 0.5μl，Buffer 2.5μl，10 mM dNTP 3.5μl，5M Betaine 5.0μl，250mM MgSO40.6 μl，Bst DNA 聚合酶 1.0μl，DNA模板 2μl，加 ddH2O 至反應體系為 25μl。65℃水浴60min，80℃滅活酶終止反應體系。反應結束后，肉眼檢測，以明顯渾濁為陽性，以未出現渾濁為陰性。分類培養(yǎng)鑒定：參考中華人民共和國衛(wèi)生部GB 4789.4-2010食品安全國家標準中的 《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》進行操作，首先將培養(yǎng)過的食品標本前增菌液搖動后取1ml轉于10mlTTB增菌液內，42℃培養(yǎng)過夜。另取1ml轉種于10mlSC增菌液內，37℃培養(yǎng)過夜。分別取食品標本的增菌液1環(huán)劃線接種于BS平板和XLD平板，37℃培養(yǎng)過夜。取3個可疑菌落接種在TSI、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基以及營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。對于具備沙門菌特征的菌落，可制備菌懸液，通過全自動微生物鑒定系統鑒定。如無沙門菌特征，則可繼續(xù)培養(yǎng)過夜，無菌落則表明為沙門菌陰性。瓊脂糖凝膠電泳：取擴增產物5μl，1%～2%的瓊脂糖凝膠電泳，分析LAMP特征性電泳圖譜。比較兩種方法檢測陽性率。

1.3 統計分析 所有數據均使用 SPSS17.0數據分析軟件進行統計學處理，采用χ2檢驗，α=0.05為檢驗水準，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

127 份食品樣本沙門菌LAMP檢測陽性14份，陽性率為11.02%；分離培養(yǎng)法檢測陽性6份，陽性率為4.72%，分別為鼠傷寒沙門菌，豬霍亂沙門菌，腸炎沙門菌。LAMP檢測陽性率明顯高于分離培養(yǎng)法，差異具有顯著性，P＜0.05。見表1。

表1 127份樣本檢測結果

電泳檢測結果顯示凝膠瓊脂糖電泳出現最小片段＞100 bp的LAMP特征性梯狀條帶為陽性。見圖1。

圖1 沙門菌LAMP擴增電泳圖

各樣本LAMP法檢測時間均在24h內，分離培養(yǎng)法檢測時間在4～7d。兩種檢測結果皆為陽性的樣本為5份，兩種檢測結果皆為陰性的樣本為112份。

3 討論

LAMP即環(huán)介導等溫擴增法，是一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，65℃恒溫擴增。其操作簡單，有強的特異性，擴增產物易檢測，在食品微生物檢驗中有廣泛的應用前景[3]。對于其結果，通過肉眼觀察白色渾濁沉淀就可以判定擴增與否。本文研究中，通過肉眼觀察渾濁確定陽性結果，結果準確可靠。本研究采用分離培養(yǎng)法和LAMP法檢測食品樣本中的沙門菌屬，其中分離培養(yǎng)法參照《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》標準進行前增菌、增菌、分離、篩選可疑菌落、生化及血清學鑒定等幾個必要步驟，一般4d可得到陰性檢測結果，需要7d左右可得到沙門菌檢測結果[4]。同時，該方法生化鑒定過程繁瑣，需要以全自動微生物鑒定系統作為基礎，血清分型效價低、試劑昂貴且易失效。相比于需要兩次增菌后才能分離培養(yǎng)的分離培養(yǎng)法，LAMP法僅需進行前增菌液核酸提取即可進行擴增實驗，1h內即可完成擴增過程，省略了大量繁瑣步驟，24h內即可完成檢測樣本中沙門菌的任務，速度快捷[5]。另外，LAMP法能夠用肉眼直接判斷結果[6]，更加直觀和可靠，在應對食物中毒的快速檢測上具有良好的應用前景。

本研究中對分離培養(yǎng)法和LAMP法檢測效果進行了比較，結果顯示LAMP法檢出率更高，但其不能夠進一步鑒定分型和分離菌株，需要與分離培養(yǎng)法配合檢測。

總體來看，LAMP法檢測食品中沙門菌屬陽性率較高，檢測時間短，與分離培養(yǎng)法配合檢測能夠有效提高食品衛(wèi)生檢驗的準確性和效率，應用和推廣價值較高。

[1]郭仲輝,陳冬雅,黎毓光,等.沙門菌的檢測及耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2013,31(01):63-64.

[2]GB 4789.4-2010.食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].2010.

[3]Parker CT,Huynh S,Quinones B,et al.Comparison of genotypes of Salmonella enterica serovar Enteritidis phage type 30 and 9c strains isolated during three outbreaks associated with raw almonds[J].Appl Environ Microbiol,2010,76(11):3723-3731.

[4]Ueda S,Kuwabara Y.The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)[J].Biocontrol Sci,2009,14(02):73-76.

[5]葉文,楊柳青,張如勝,等.沙門菌屬LAMP檢測方法在食品衛(wèi)生檢驗中的應用評價[J].中華疾病控制雜志,2011,15(09):785-787.

[6]張宏偉,葉露萌,彭楊思,等.利用環(huán)介導等溫擴增技術對沙門氏菌進行檢測[J].食品研究與開發(fā),2009,30(05):115-118.