徐慧+戴元榮+胡丹紅+夏夢(mèng)玲

[摘要] 目的 觀察羅紅霉素對(duì)煙霧暴露哮喘小鼠組蛋白去乙酰化酶（HDAC2）表達(dá)的影響，探討羅紅霉素對(duì)煙霧暴露哮喘患者可能的治療作用。方法 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組（C）、哮喘組（A）、煙霧暴露組（S）、羅紅霉素組（R）4組。用卵白蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法制備哮喘和煙霧暴露模型，并用羅紅霉素干預(yù)。觀察各組小鼠肺組織病理超微結(jié)構(gòu)變化，分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，并采用Western blot法測(cè)定各組小鼠肺組織中HDAC2表達(dá)情況。結(jié)果 哮喘組和煙霧暴露組嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比例均顯著高于對(duì)照組（均P<0.01），煙霧暴露組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比例顯著高于哮喘組（P<0.01）；羅紅霉素組與煙霧暴露組相比，嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞比例明顯下降（P<0.01）。哮喘組和煙霧暴露組肺組織HDAC2表達(dá)均低于對(duì)照組，煙霧暴露組低于哮喘組（均P<0.01）， 羅紅霉素組肺組織HDAC2表達(dá)高于煙霧暴露組（均P<0.01）。結(jié)論羅紅霉素可能通過(guò)上調(diào)HDAC2，改善煙霧暴露小鼠氣道炎癥。

[關(guān)鍵詞] 哮喘；香煙煙霧；組蛋白脫乙?；割?；羅紅霉素

[中圖分類號(hào)] R563.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）30-0001-03

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，其患病率和死亡率目前呈上升趨勢(shì)。嗜酸粒細(xì)胞炎癥是哮喘的重要特征，而吸煙哮喘患者氣道卻是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主。吸煙是影響哮喘發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，可增加哮喘發(fā)生的頻率和癥狀的嚴(yán)重程度，而且煙霧暴露哮喘患者存在對(duì)激素治療不敏感[1]等問(wèn)題。因此研究吸煙哮喘患者發(fā)病機(jī)理具有重要意義。哮喘發(fā)病危險(xiǎn)因素中最重要的是遺傳和環(huán)境因素，由于遺傳背景不可能在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著變化，因此，環(huán)境因素可能起到關(guān)鍵作用。研究表明組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是激素發(fā)揮抗炎作用的中介，HDAC2活性的下降會(huì)導(dǎo)致哮喘患者對(duì)激素敏感性下降[2]。羅紅霉素是臨床上常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其除了抗菌作用外，還表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立煙霧暴露哮喘小鼠模型，并用羅紅霉素干預(yù)，觀察羅紅霉素對(duì)HDAC2的影響，為尋找對(duì)煙霧暴露哮喘患者有效藥物提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠40只，體重18～22 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。紅塔山牌過(guò)濾嘴香煙（云南省玉溪卷煙廠生產(chǎn)，焦油含量13 mg/支，煙氣一氧化碳量13 mg/支）；免疫組化試劑盒和GAPDH（碧云天生物技術(shù)研究所）；HDAC2（美國(guó)CST公司）；卵白蛋白（OVA）干粉，羅紅霉素粉劑（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1煙霧暴露哮喘模型的復(fù)制 40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)平均分為對(duì)照組（C）、哮喘組（A）、煙霧暴露組（S）、羅紅霉素組（R）。哮喘組和煙霧暴露組第1天和第14天小鼠腹腔內(nèi)注射0.2 ml OVA/Al（OH）3混合液[其中OVA 0.1 mg，Al（OH）3 1 mg]致敏；第21天開始霧化吸入1%OVA的生理鹽水 8 mL激發(fā)，每次30 min，共18 d。煙霧暴露組從1%OVA霧化激發(fā)開始，每日于霧化激發(fā)后，參照文獻(xiàn)[4]自制半封閉小鼠吸煙箱，每次點(diǎn)燃2支香煙燃燒8 min，休息5 min后再點(diǎn)燃2支，共10支，1次/d，共18 d。羅紅霉素組在煙霧暴露組的基礎(chǔ)上每次激發(fā)前半小時(shí)予以羅紅霉素40 mg/kg灌胃。對(duì)照組用等量生理鹽水代替OVA激發(fā)和羅紅霉素灌胃，最后一次激發(fā)后處死，取支氣管肺泡灌洗液（BALF）及肺組織標(biāo)本備用。

1.2.2 各組小鼠肺組織病理超微結(jié)構(gòu)的變化 石蠟切片HE染色后光鏡下觀察各組肺組織結(jié)構(gòu)，支氣管及血管周圍炎癥浸潤(rùn)情況，有無(wú)上皮損傷。

1.2.3 BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù) BALF沉渣用1 mLPBS液重懸，取一滴滴于載玻片上涂片，自然晾干后加瑞氏液固定，再加等量緩沖液與染料混勻，染色5～10 min，沖去染液。選擇涂片體尾交界處染色良好的區(qū)域，在高倍鏡下，按一定順序移動(dòng)視野，根據(jù)形態(tài)特征對(duì)200個(gè)白細(xì)胞做細(xì)胞分類檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)HDAC2蛋白表達(dá) 將各組小鼠肺組織用適量蛋白裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后， 按每孔40 μg蛋白量加樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜。一抗用兔抗小鼠HDAC2（1﹕600），二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔（1﹕5000），室溫孵育1～2 h，洗膜，ECL顯影。采用Band Scan電泳圖像分析軟件，以GAPDH蛋白為內(nèi)參，以目的蛋白和內(nèi)參的吸光度的比值代表目的蛋白的相對(duì)含量，進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差不齊者用 Dunnett T3 檢驗(yàn)，方差齊者用Tukey檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織顯微結(jié)構(gòu)變化

肺組織切片HE染色后，光鏡下可見C組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管及血管周圍未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。A組小鼠肺組織內(nèi)支氣管壁各層黏膜皺褶增多，支氣管上皮斷裂、脫落及較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。S組肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，肺泡間隔斷裂或者變薄，氣道壁明顯增厚，支氣管平滑肌肥大，大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。R組少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁輕度增厚，跟S組相比，炎癥癥狀明顯減輕，見圖1。

2.2 各組小鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

由表1可見，哮喘組以嗜酸性粒細(xì)胞升高為主，而煙霧暴露組則以中性粒細(xì)胞升高為主，煙霧暴露組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比例明顯高于哮喘組（P<0.01），哮喘組和煙霧暴露組與對(duì)照組相比中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比例均升高（均P<0.01），羅紅霉素組與煙霧暴露組相比嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞明顯下降（P<0.05或P<0.01）。