全娟花 李 鵬 喻才元 楚佳奇

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與細(xì)胞治療中心，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東湛江 524001)

剛地弓形蟲Toxoplasmagondii是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲，可引起人獸共患的弓形蟲病，尤其對(duì)孕婦、免疫抑制和免疫缺陷患者的影響更為嚴(yán)重(Pappasetal. , 2009；Sakikawaetal. , 2012)。近年來(lái)，弓形蟲疫苗經(jīng)歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗和核酸疫苗等研究階段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全蟲疫苗和蟲體特異組分疫苗能夠預(yù)防弓形蟲感染或降低感染程度，但前者易引起再感染，后者的免疫保護(hù)作用較差(Angusetal., 2000；Innesetal., 2006)。DNA疫苗是將編碼抗原的基因插入載體質(zhì)粒中構(gòu)成重組體，直接接種機(jī)體，在接種部位攝取表達(dá)并達(dá)到抗感染目的的一種疫苗。它的優(yōu)點(diǎn)是內(nèi)源性表達(dá)的抗原以天然構(gòu)型出現(xiàn)，誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答。DNA疫苗相較于傳統(tǒng)的滅活及減毒疫苗更加高效并克服了回復(fù)突變的潛在危險(xiǎn)，相較于基因工程多肽疫苗降低了成本和簡(jiǎn)化了制備過(guò)程(Ismaeletal., 2003；Fachadoetal., 2003)。

近年研究表明，含有人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，CMV)高效啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列的真核表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)成為DNA疫苗載體。當(dāng)前，有不少學(xué)者對(duì)弓形蟲表面膜抗原(Surface antigen，SAG)基因、棒狀體蛋白(Rhoptry protein，ROP)基因、致密顆粒(Dense granule protein，GRA)基因、微線體蛋白(Microneme protein，MIC)等進(jìn)行核酸疫苗研究(李運(yùn)娜等, 2011)。SAG2是由P22基因編碼的天然蛋白質(zhì)，只在弓形蟲的侵入期速殖子表達(dá)?？筍AG2抗體能阻止蟲體在宿主細(xì)胞膜的固定附著，從而阻止其入侵宿主細(xì)胞，并促使包囊的形成增加，SAG2在弓形蟲感染的免疫中發(fā)揮一定的作用(Rachineletal., 2004)。高世同等(2004)針對(duì)弓形蟲SAG2編碼基因構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SAG2，并接種小鼠發(fā)現(xiàn)，免疫組小鼠血清中出現(xiàn)抗弓形蟲特異性IgG抗體并且能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。致密顆粒蛋白(GRA)是弓形蟲致密顆粒細(xì)胞器分泌的一類具有免疫活性的蛋白質(zhì)。它們?cè)谛揎椪{(diào)理納蟲泡中起重要作用，并關(guān)聯(lián)于泡內(nèi)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，參與蟲體在細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制(Desolmeetal. , 2000)。有研究報(bào)道，用pVAC-GRA4真核表達(dá)重組質(zhì)粒免疫小鼠，觀察誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其對(duì)弓形蟲感染的保護(hù)作用，結(jié)果顯示pVAC-GRA4免疫組小鼠存活率顯著高于對(duì)照組，誘導(dǎo)產(chǎn)生以細(xì)胞免疫為主的免疫應(yīng)答(林綺萍等, 2005)。

DNA疫苗在抗弓形蟲病方面具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)外以開(kāi)展較多，但有關(guān)弓形蟲pSAG2-GRA2雙基因疫苗的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選用SAG2和GRA2基因作為重組子，以pCMV-Taq2B為載體，利用基因重組技術(shù)，成功制備了pSAG2、pGRA2及pSAG2-GRA2。DNA疫苗直接肌注免疫小鼠，觀察其在宿主細(xì)胞內(nèi)不斷表達(dá)及在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并通過(guò)動(dòng)物攻擊實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果，為構(gòu)建安全有效的弓形蟲DNA疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；核酸內(nèi)切酶BamHI、PstI、EcoRI、EcoRV、T4連接酶均為Roche公司產(chǎn)品；胎牛血清、RPMI1640、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、Opti-MEM和Lipofectamine LTX&PLUS均為Gibco公司產(chǎn)品；GelRed是Biotium公司產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 質(zhì)粒pCMV-Taq2B、FHs 74 Int細(xì)胞株、大腸桿菌DH5α為本室保存。

1.1.3 弓形蟲RH株由韓國(guó)忠南大學(xué)醫(yī)學(xué)院感染生物學(xué)教研室教授Young-Ha Lee饋贈(zèng)。BALB/c及ICR小鼠，6周齡左右，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建：按照所選取的目的片段由武漢博洪生物科技有限公司設(shè)計(jì)以下兩對(duì)引物：SAG2，C G C G G A T C C T C A A A G A C C A C G A G C C T A GC和A A T C T G C A G C T T G C C C G T G A G A G A C A C AG，下劃線部分分別為BamHI、PstI酶切位點(diǎn)；GRA2，C C G G A A T T C A T G T T C G C C G T A A A A C A T TG和A A T G A T A T C T T G G G G C T C C A C T G G A A C CT，下劃線部分分別為EcoRI、EcoRV酶切位點(diǎn)。以弓形蟲RH株速殖子cDNA為模板擴(kuò)增SAG2和GRA2目的片段。按常規(guī)方法將該目的基因分別插入pCMV-Taq2B真核表達(dá)質(zhì)粒BamHI、PstI和EcoRI、EcoRV酶切位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序鑒定正確后命名為pSAG2和pGRA2。SAG2目的基因插入pGRA2質(zhì)粒BamHI、PstI酶切位點(diǎn)之間，該重組質(zhì)粒命名為pSAG2-GRA2。

1.2.2 質(zhì)粒DNA的提取及純化：堿裂解法分別提取重組質(zhì)粒pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2和空質(zhì)粒pCMV-Taq2B，溶于滅菌PBS。定量使得濃度均為1 mg/mL。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將FHs 74 Int人小腸上皮細(xì)胞以1×105每孔接種于6孔板中，加入2 mL培養(yǎng)基(含有10% FBS和20 ng/mL EGF的RPMI1640)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)參照Lipofectamine LTX&PLUS轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)SAG2和GRA2 mRNA表達(dá)：按Trizol試劑說(shuō)明提取轉(zhuǎn)染FHs 74 Int細(xì)胞總RNA，按M-MLV cDNA合成試劑盒說(shuō)明合成cDNA第一鏈并用上述的SAG2和GRA2引物按照說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.2.5 DNA疫苗的免疫接種：取SPF級(jí)雌性8周齡BALB/c小鼠115只，隨機(jī)分為5組，即注射PBS、pCMV-Taq2B空質(zhì)粒對(duì)照組和注射重組質(zhì)粒pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2實(shí)驗(yàn)組，每組23只。小鼠雙側(cè)脛前肌相同部位分別注射50 μL(50 μg)質(zhì)粒，每只小鼠每次免疫的質(zhì)?？偭繛?00 μg。于初次免疫后第14、28 d分別加強(qiáng)免疫。

1.2.6 弓形蟲速殖子培養(yǎng)裂解物(TLA)的制備：將復(fù)蘇后的弓形蟲RH強(qiáng)毒株腹腔注射ICR小鼠，待小鼠出現(xiàn)癥狀(如豎毛、不食、肛門拖糞、呼吸困難等)后，用生理鹽水沖洗腹腔，抽取腹腔液再腹腔注射給其他ICR小鼠傳代，3 d傳代1次。收集腹腔中的速殖子，洗滌后懸浮于PBS，反復(fù)凍融10次。離心后取上清經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾后，即為 TLA。

1.2.7 ELISA 法測(cè)定小鼠血清IgG：分別于免疫前及末次免疫后第14、28 d，小鼠斷尾法取血，分離收集小鼠血清。將每次所取血清樣品用間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠IgG抗體，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(Quanetal. , 2012)。

1.2.8 免疫小鼠抗弓形蟲攻擊感染實(shí)驗(yàn)：每組小鼠(n=20)均注射經(jīng)ICR小鼠腹腔傳代的弓形蟲RH株速殖子，注射劑量1 000個(gè)/鼠，監(jiān)測(cè)小鼠存活時(shí)間。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析檢驗(yàn)(One-way ANOVA)，P< 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒在小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)

以弓形蟲RH株cDNA為模板，擴(kuò)增出SAG2和GRA2片段，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期值相符(圖1)。對(duì)構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果與GenBank收錄的SAG2和GRA2序列完全一致，基因讀碼框架正確。為了鑒定pSAG2、pGRA2及pSAG2-GRA2 DNA疫苗能否成功表達(dá)具有免疫原性的SAG2和GRA2蛋白，本實(shí)驗(yàn)以pCMV-Taq2B空載體為對(duì)照轉(zhuǎn)染FHs 74 Int細(xì)胞，用RT-PCR法在轉(zhuǎn)錄水平鑒定SAG2和GRA2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，在經(jīng)pSAG2、pGRA2或pSAG2-GRA2轉(zhuǎn)染的小腸上皮細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出一條DNA片段，該片段大小與SAG2、GRA2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致(圖2)。而在未轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照小腸上皮細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中雖能擴(kuò)增出GAPDH mRNA，但未檢測(cè)到SAG2或GRA2 mRNA，從而證實(shí)SAG2和GRA2在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有效表達(dá)。

圖1 弓形蟲表面膜抗原2(SAG2)和致密顆粒蛋白2(GRA2)PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of Toxoplasma gondii Surface antigen 2(SAG2)and Dense granule protein 2(GRA2)

圖2 RT-PCR 檢測(cè)FHs 74 Int轉(zhuǎn)染細(xì)胞中弓形蟲表面膜抗原2(SAG2)和致密顆粒蛋白2(GRA2)基因mRNA的表達(dá)結(jié)果Fig.2 Expression of Toxoplasma gondii Surface antigen 2(SAG2)and dense granule protein 2(GRA2)mRNA in FHs 74 Int transfected cells by RT-PCR

2.2 免疫小鼠弓形蟲特異性抗體應(yīng)答

ELISA結(jié)果(圖3)表明，pSAG2、pGRA2和pSAG2-GRA2基因疫苗免疫組小鼠均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG抗體，均于末次免疫后第28 d達(dá)到最高值，此時(shí)pSAG2(0.265±0.087)、pGRA2(0.382±0.66)和pSAG2-GRA2(0.548±0.137)免疫組吸光度值(OD490 nm)顯著高于免疫前吸光度值(0.139±0.017、0.136±0.007、0.134±0.009)(P<0.05)，表明基因疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的IgG抗體為陽(yáng)性?；蛞呙缃M血清抗體的吸光度值均高于空載體和PBS陰性對(duì)照組，尤其是pGRA2(0.382±0.66)和pSAG2-GRA2(0.548±0.137)組吸光度值顯著高于PBS(0.137±0.016)或pCMV-Taq2B(0.135±0.010)對(duì)照組吸光度值(P<0.05)。

圖3 ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中IgG抗體Fig.3 Detection of IgG in serum of immunized mice by ELISA

2.3 抗攻擊保護(hù)作用

為了評(píng)價(jià)DNA疫苗對(duì)急性弓形蟲感染的保護(hù)作用，末次免疫后第28 d每只小鼠經(jīng)腹腔注射1 000個(gè)速殖子后每天觀察生存時(shí)間(d)直到所有攻擊感染的小鼠死亡。 攻擊小鼠2～3 d后，免疫基因疫苗pSAG2、pGRA2及pSAG2-GRA2的實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動(dòng)及飲食減少等表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠均未能耐受攻擊弓形蟲RH株速殖子攻擊感染。小鼠攻蟲感染后的存活率曲線見(jiàn)圖4，免疫單基因疫苗pSAG2(14.3±1.8)、pGRA2組(13.5±2.1)小鼠存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于PBS(4.3±1.6)及pCMV-Taq2B對(duì)照組(4.1±1.3)(P<0.05)，且雙基因疫苗pSAG2-GRA2組(19.6±2.4)小鼠存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于單基因疫苗pSAG2組及pGRA2組(P<0.05)，證明真核表達(dá)質(zhì)粒pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2作為DNA疫苗進(jìn)行免疫能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的針對(duì)弓形蟲感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，使實(shí)驗(yàn)小鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且雙基因疫苗優(yōu)于單基因疫苗。

圖4 腹腔注射弓形蟲速殖子后免疫小鼠生存率Fig.4 Survival rate of mice in different groups after oral challenged with T. gondii tachyzoite

3 討論

DNA疫苗可通過(guò)多種途徑進(jìn)行，溶于PBS后，可直接肌肉、皮內(nèi)、皮下或靜脈注射，也可將其沉淀到金顆粒上，通過(guò)基因槍導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。其中直接肌注法是目前比較認(rèn)可的有效途徑之一。本研究構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pSAG2、pGRA2和pSAG2-GRA2并應(yīng)用脛前肌直接肌注法疫苗免疫小鼠，引發(fā)了免疫保護(hù)反應(yīng)。

pSAG2、pGRA2和pSAG2-GR2基因疫苗實(shí)驗(yàn)組血清IgG抗體濃度均隨免疫接種次數(shù)的增多而顯著增高，尤其在末次免疫接種28 d后血清抗體濃度達(dá)到最高水平，兩對(duì)照組血清中抗體濃度無(wú)變化。實(shí)驗(yàn)組血清抗體濃度均高于空載體和PBS陰性對(duì)照組，尤其pSAG2-GRA2組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。攻擊感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基因疫苗實(shí)驗(yàn)組感染小鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但最終均未能存活，其主要原因可能是本實(shí)驗(yàn)中弓形蟲速殖子毒力完好且攻擊量(1 000/鼠)較高，疫苗誘導(dǎo)的機(jī)體免疫應(yīng)答不能完全清除感染的速殖子。弓形蟲自然感染中間宿主的主要途徑是卵囊經(jīng)口感染，若攻擊感染改用經(jīng)口途徑模擬自然感染，或用弱毒株進(jìn)行攻擊感染，則更能較客觀地評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果。Wu等(2012)研究顯示，用真核表達(dá)載體pVAX1-GRA1和pVAX1-SAG1對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠作直接的肌肉注射，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗攻擊保護(hù)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

本研究通過(guò)對(duì)免疫小鼠特異性抗體測(cè)定和抗弓形蟲攻擊感染實(shí)驗(yàn)，證明抗弓形蟲單基因疫苗pSAG2、pGRA2和雙基因疫苗pSAG2-GRA2能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生部分抗弓形蟲保護(hù)性免疫應(yīng)答。尤其pSAG2-GRA2雙基因疫苗免疫小鼠所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用，可顯著降低弓形蟲感染所致的死亡率。本研究為構(gòu)建安全有效的弓形蟲DNA疫苗提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。