王 丹 李 超 焦雅清 汪運(yùn)舟 陶鴿如 顧小龍, 方素芳 崔 平 劉賢勇** 索 勛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193; 2.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院， 河北張家口 075000)

兔球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的、嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的寄生蟲病(Pakandl, 2009)。兔球蟲感染引發(fā)球蟲病的同時(shí)還會繼發(fā)感染產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等，引起混合感染(Jingetal., 2012)。河北(崔平等，2010)、江蘇(宋鴻雁等，2012)、浙江(簡永利等，2014)等地區(qū)兔球蟲感染情況的調(diào)查結(jié)果顯示，家兔球蟲感染率均在60%以上，甚至高達(dá)100%。其中以穿孔艾美耳球蟲Eimeriaperforans、中型艾美耳球蟲E.media、大型艾美耳球蟲E.magna、無殘艾美耳球蟲E.irresidua、腸艾美耳球蟲E.intestinalis和盲腸艾美耳球蟲E.coecicola為主要感染蟲種(Jingetal., 2012)。

普遍認(rèn)為斷奶至3月齡仔兔感染兔球蟲最為嚴(yán)重(Sherkovetal., 1986)，但是此日齡范圍內(nèi)的家兔對球蟲易感性差異尚未有報(bào)道，對其進(jìn)行深入研究對于更加合理地進(jìn)行藥物防治和研究宿主抗球蟲免疫有著十分重要的意義。

新西蘭白兔是我國常見的肉用商品兔，具有繁殖力強(qiáng)、生長快、周期短等優(yōu)勢，70日齡時(shí)即開始出欄。因此，本研究根據(jù)新西蘭白兔生長周期，選擇30、50和70日齡幼兔，研究其對中型艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲的易感性，據(jù)此判斷球蟲對不同日齡兔的危害程度，進(jìn)而為今后不同生長階段的新西蘭白兔的球蟲病防控提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與蟲株

新西蘭白兔購自北京興隆實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖廠，飼養(yǎng)于無球蟲環(huán)境中，1籠2只，飼喂經(jīng)80℃烘烤2 h的飼料和飲水，糞檢無球蟲感染者用于本次實(shí)驗(yàn)。

選擇中度致病、潛隱期較長的無殘艾美耳球蟲E.irresidua(Nortonetal., 1979)和潛隱期較短的中型艾美耳球蟲E.media(Licoisetal., 1994)作為實(shí)驗(yàn)用蟲種。實(shí)驗(yàn)用蟲種源自2010年對河北地區(qū)兔球蟲種類及感染率進(jìn)行調(diào)查時(shí)分離并保存的中型艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲(崔平等，2010)。分別將5 000個(gè)孢子化卵囊接種于無球蟲兔，收集顯現(xiàn)期糞便中的卵囊，經(jīng)28℃孵育至孢子化，獲得中型艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲卵囊。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取30、50和70日齡的無球蟲新西蘭白兔各12只，共36只。用5 000個(gè)孢子化的中型艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲卵囊分別接種不同日齡的兔各6只。在接種后第4～9 d(接種中型艾美耳球蟲組)和接種后第8～14 d(接種無殘艾美耳球蟲組)內(nèi)，觀察各組實(shí)驗(yàn)兔精神狀態(tài)、采食飲水、排便等情況是否正常。在顯現(xiàn)期內(nèi)每日收集每個(gè)日齡組的糞便，用于卵囊排出量統(tǒng)計(jì)。

將每份糞樣充分破碎混勻后從中抓取3份，每份2 g，置于小燒杯中，倒入60 mL飽和食鹽水，吸取充分?jǐn)嚢璧幕鞈乙撼淙敫牧见溈笋R氏計(jì)數(shù)板中，靜置3～5 min后，置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。所計(jì)卵囊數(shù)量乘以200即該樣品的每克糞便卵囊量(Oocysts per gram, OPG)。排卵囊總量=OPG ×糞重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組OPG和卵囊排出總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對組間差異性進(jìn)行單因素ANOVA分析，圖片用Graphpad Prism5.0軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

30日齡的幼兔接種后均出現(xiàn)了精神沉郁、飲食減少和腹瀉等癥狀；50日齡接種兩種球蟲的幼兔則分別有3和2只出現(xiàn)便秘的癥狀，但并無腹瀉癥狀的出現(xiàn)；70日齡感染組則僅有1只接種中型艾美耳球蟲的個(gè)體出現(xiàn)輕微的癥狀(表1)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔顯現(xiàn)期臨床癥狀Tab. 1 Clinical sign of rabbits during patent period

圖1 不同日齡家兔接種中型艾美耳球蟲后顯現(xiàn)期內(nèi)OPG及排卵囊總量Fig. 1 OPG and total oocyst output of rabbits inoculated with Eimeria media during patent periodA：每克糞便卵囊量；B：排卵囊總量；*：P<0.05。圖2同。A：Oocyst per gram (OPG)；B：Total oocyst output; *: P<0.05. The same with Fig.2.

2.2 中型艾美耳球蟲卵囊排出情況

結(jié)果顯示不同日齡的幼兔對中型艾美耳球蟲的易感性有著較大差異。在卵囊顯現(xiàn)期，各個(gè)日齡幼兔糞便OPG檢測值差異極為顯著(圖1-A)，30日齡的幼兔卵囊排出水平遠(yuǎn)高于其他兩組(圖1-B)。從卵囊顯現(xiàn)期的第2 d開始，每日卵囊排出量隨著日齡增加而下降。糞便OPG和每日卵囊排出量的檢測值表明新西蘭白兔對于中型艾美耳球蟲的易感性隨著日齡的變化有著較大差異。

2.3 無殘艾美耳球蟲卵囊排出情況

本次實(shí)驗(yàn)中，感染無殘艾美耳球蟲的30、50、70日齡家兔的糞便總卵囊排出量分別為1.2×107、2.7×107和1.6×107(圖2-B)。從造成臨床癥狀的嚴(yán)重程度來看，雖然50日齡兔卵囊排出量最高，但30日齡兔癥狀最為嚴(yán)重(表1)。30日齡兔感染無殘艾美耳球蟲球蟲后，其顯現(xiàn)期的飲水飼料消耗均少于其他兩組，有便秘、腹瀉交替現(xiàn)象，糞便量極少。這些數(shù)據(jù)顯示30日齡斷奶前后的仔兔對無殘艾美耳球蟲更易感。

圖2 不同日齡家兔接種無殘艾美耳球蟲后顯現(xiàn)期OPG及排卵囊總量Fig. 2 OPG and total oocyst output of rabbits inoculated with Eimeria irresidua during patent period

3 討論

本研究對30、50、70日齡家兔分別接種相同劑量的中型艾美耳球蟲和無殘艾美耳球蟲，通過對糞便OPG和卵囊排出總量的統(tǒng)計(jì)以及臨床癥狀的觀察發(fā)現(xiàn)，30日齡的仔兔對球蟲更易感。

研究表明未斷奶仔兔對球蟲不易感(Coudertetal., 1991; Pakandletal., 2007)，可能原因是母乳在抵抗球蟲感染時(shí)起到重要的作用(Rose, 1973)。當(dāng)未斷奶仔兔開始吃料，其腸道菌群發(fā)生改變，隨日齡增加，未斷奶仔兔對球蟲易感性增強(qiáng)，排卵囊量增加(Pakandletal., 2007)。另一方面，更大日齡家兔對球蟲的易感性降低，可能原因是免疫系統(tǒng)的日趨完善，腸道菌群穩(wěn)定。針對家兔腸道免疫系統(tǒng)的研究顯示，家兔出生后6周隱窩生發(fā)中心出現(xiàn)B細(xì)胞，直至9周齡時(shí)，隱窩處才出現(xiàn)T細(xì)胞(Mage, 1998)。

目前，兔球蟲病的防控仍然以藥物防治為主，但長期用藥造成藥物殘留給食品安全帶來風(fēng)險(xiǎn)。參考本研究結(jié)果，有針對性地對斷奶前后的仔兔進(jìn)行藥物防治，高日齡兔加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，可減輕藥物殘留的危害，避免兔球蟲感染帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究僅對新西蘭白兔的幼兔進(jìn)行了2種兔球蟲易感性研究，并未涉及其他毛兔或者獺兔，鑒于各類商品兔在其生長周期和個(gè)體發(fā)育上的差異，有必要對其他種類的兔進(jìn)行研究，比較宿主之間易感性差異，為抗球蟲免疫的探索提供研究基礎(chǔ)。