湯新明 秦 梅 索靜霞 田秀玲 劉賢勇 索 勛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

和緩艾美耳球蟲(chóng)Eimeriamitis是7種雞球蟲(chóng)中常見(jiàn)的一種，致病力較弱，容易被忽視，但其繁殖力較強(qiáng)，大劑量感染后可引起腸道嚴(yán)重炎性反應(yīng)，損傷腸上皮細(xì)胞，誘發(fā)和加劇其他病原如沙門(mén)氏菌等的繼發(fā)感染 (索勛等, 1998; Williams, 2001)。因此，了解和緩艾美耳球蟲(chóng)激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的特點(diǎn)和規(guī)律對(duì)于防控和緩艾美耳球蟲(chóng)病及降低由該病引發(fā)的其他損失如病原的繼發(fā)感染，提高飼料轉(zhuǎn)化率等至關(guān)重要。

雞球蟲(chóng)免疫研究以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)E.tenella與巨型艾美耳球蟲(chóng)E.maxima居多。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)免疫原性強(qiáng)，能激發(fā)宿主較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答 (Huangetal., 2011; Renetal., 2014)。目前認(rèn)為，細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗球蟲(chóng)再次感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的作用機(jī)制，抗體在抗球蟲(chóng)感染中的作用存在爭(zhēng)議 (Pierceetal., 1965; Roseetal., 1971; Lillehojetal., 2000)。雞球蟲(chóng)不同種間的免疫原性差別很大，巨型艾美耳球蟲(chóng)免疫原性最強(qiáng)，口服接種1個(gè)或幾個(gè)卵囊就可以產(chǎn)生對(duì)同種球蟲(chóng)再次感染的保護(hù)力，但是，巨型艾美耳球蟲(chóng)對(duì)不同株間的交叉免疫保護(hù)又非常弱，這也是巨型艾美耳球蟲(chóng)免疫的特點(diǎn)之一 (Swinkelsetal., 2009)；柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同蟲(chóng)株間的免疫保護(hù)效果良好 (Chapmanetal., 2013)。上述研究結(jié)果表明，不同種球蟲(chóng)間的免疫有其共性，每個(gè)種又有著其自身的特點(diǎn)和規(guī)律。因此，研究和緩艾美耳球蟲(chóng)激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的特點(diǎn)和規(guī)律，為防控該病提供理論依據(jù)，需以和緩艾美耳球蟲(chóng)為研究對(duì)象。

關(guān)于和緩艾美耳球蟲(chóng)免疫原性及免疫應(yīng)答規(guī)律的認(rèn)識(shí)差異很大，有人認(rèn)為和緩艾美耳球蟲(chóng)免疫原性極弱，只有經(jīng)過(guò)多次免疫才能建立對(duì)和緩艾美耳球蟲(chóng)再次感染的免疫力 (Tyzzer, 1929; Fitz-Coy, 1980)；有人認(rèn)為和緩艾美耳球蟲(chóng)免疫原性良好，雞群免疫1次或2次就能建立堅(jiān)強(qiáng)的免疫力 (趙愛(ài)云等, 2006)。同樣是和緩艾美耳球蟲(chóng)，免疫原性出現(xiàn)如此差異，可能與研究時(shí)選用不同蟲(chóng)株有關(guān)，本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的和緩艾美耳球蟲(chóng)涿州株為研究對(duì)象，研究其免疫原性及激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的特征，初步揭示宿主抵抗和緩艾美耳球蟲(chóng)感染的機(jī)制，為后續(xù)球蟲(chóng)免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與蟲(chóng)株

1.1.1 蟲(chóng)株：和緩艾美耳球蟲(chóng)涿州株，由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1日齡AA肉雞購(gòu)自北京華都肉雞有限公司，飼養(yǎng)于無(wú)球蟲(chóng)污染的禽用隔離器(IPQ-3型，蘇州市蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠)中，自由采食、飲水。

1.1.3 主要試劑：Chicken IgG(IgY)-Fc Fragment antibody (Bethyl Laboratories, Inc)，TMB (A+B)(邁晨科技)，人淋巴細(xì)胞分離管、Lympho-SpotTM無(wú)血清培養(yǎng)基、鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體、AEC顯色液(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，96孔ELISPOT板(Millipore)，生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體(1 μg/mL，CHICKEN IFN GAMMA CYTOSET，Invitrogen)等。

1.2 免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

免疫程序見(jiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖1)。簡(jiǎn)言之，12只7日齡AA肉雞隨機(jī)分為2組，免疫組以1 000卵囊/羽劑量(200 μL)進(jìn)行口服免疫，對(duì)照組口服免疫200 μL PBS；第2次免疫于初免后14 d進(jìn)行，免疫劑量為10 000卵囊/羽。

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig.1 The experimental schedule

1.3 卵囊排出量統(tǒng)計(jì)

糞便中卵囊含量檢測(cè)依據(jù)參考文獻(xiàn)(Yanetal., 2009)。初免和二免后5～8 d糞便，充分混勻后稱(chēng)重，利用麥克馬斯特法計(jì)算克糞便卵囊數(shù)(OPG)后計(jì)算卵囊排出量。每份樣品重復(fù)3次。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA相關(guān)操作依據(jù)參考文獻(xiàn) (Huangetal., 2011)。球蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原5 μg/mL 4℃過(guò)夜包被；5%脫脂乳37℃封閉1 h；雞群一免和二免14 d后血清1∶100稀釋作為一抗，37℃孵育1 h；Chicken IgG(IgY)-Fc Fragment antibody 1∶10 000稀釋作為二抗，37℃孵育1 h(上述各操作均需PBST洗滌5次)；TMB (A+B) 顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止顯色后置于酶標(biāo)儀(BIO-RAD)中，450 nm波長(zhǎng)讀取OD值。

1.5 外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)的分離

雞外周血單核淋巴細(xì)胞的分離依據(jù)人淋巴細(xì)胞分離管的操作說(shuō)明。無(wú)菌靜脈采集二免后2周雞外周抗凝血5 mL，加入分離管，20℃，800 g，離心15 min，吸取淋巴細(xì)胞層(血漿層下，白色薄層)，加入10 mL 1640培養(yǎng)基洗滌一次，Lympho-SpotTM無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取50 μL細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后用于ELISPOT檢測(cè)。

1.6 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)

ELISPOT相關(guān)操作依據(jù)參考文獻(xiàn) (Yinetal., 2013)。96孔ELISPOT板(Millipore)甲醇預(yù)濕后， 5 μg/mL雞IFN-γ包被抗體4℃過(guò)夜包被；1% BSA室溫封閉2 h；每孔加106PBMC后，分別加入10 μL PBS置于37℃、10 μL球蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原(5 μg/mL)、10 μl PMA+離子霉素(2.5 ng/mL + 1.25 μg/mL)，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱刺激24 h(期間切勿移動(dòng)培養(yǎng)板)；迅速倒掉孔內(nèi)細(xì)胞，加200 μL冷水裂解細(xì)胞10 min；加入100 μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育2 h；加入100 μL鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體(2 μg/mL，ALL-IN-ONE mouse ELISPOT Accessory kit)，37℃孵育1 h(上述各操作均需PBST洗滌8次)；加入100 μL AEC顯色液(ALL-IN-ONE mouse ELISPOT Accessory kit)進(jìn)行顯色，室溫避光孵育30 min；去離子水洗滌2次，室溫風(fēng)干，用ELISPOT讀數(shù)儀(Bioreader 4000; Bio-sys, Germany)進(jìn)行讀數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理，差異顯著性分析采用IBM SPSS Statistics 20軟件中單因素ANOVA分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著，P<0.01認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 和緩艾美耳球蟲(chóng)免疫原性的研究

本研究檢測(cè)了初免及二免后雞群的卵囊產(chǎn)量以評(píng)估和緩艾美耳球蟲(chóng)的免疫原性。結(jié)果顯示，1 000卵囊/羽免疫后每只雞的卵囊產(chǎn)量約1×107，14 d后免疫劑量提高10倍(即10 000卵囊/羽)，但每只雞的卵囊排出僅為5×105(圖2)。與初次免疫相比，再次免疫后的卵囊排出量顯著降低。

圖2 一次免疫和二次免疫后的卵囊排出量Fig.2 The oocysts output of each bird post primary and boost immunization 5-8 days.p.p.i : 一次免疫；p.b.i: 二次免疫；** P<0.01。p.p.i : Post primary immunization; p.b.i: Post boost immunization. ** P<0.01. The same below.

2.2 和緩艾美耳球蟲(chóng)激發(fā)宿主體液免疫應(yīng)答的特征

球蟲(chóng)感染一般能激發(fā)宿主較高水平的抗體反應(yīng)，即使抗體在抗球蟲(chóng)感染中的作用存在爭(zhēng)議，檢測(cè)球蟲(chóng)激發(fā)宿主特異性抗體的水平仍能部分反應(yīng)體液免疫應(yīng)答在抗球蟲(chóng)感染中的作用強(qiáng)度。本研究檢測(cè)了初免和二免后14 d血清中球蟲(chóng)特異性IgY抗體的水平，發(fā)現(xiàn)一次免疫幾乎不能激發(fā)宿主特異性抗體的產(chǎn)生(OD值<0.5)；二次免疫后，雖然免疫組OD值顯著高于對(duì)照組，但血清抗體水平的絕對(duì)值(OD值約為1.1)仍保持較低水平(圖3)。

圖3 一次免疫(p.p.i)和二次免疫(p.b.i)后雞群血清中特異性IgY抗體的水平Fig. 3 Serum IgY titer post both primary and boost immunization with E. mitis

2.3 和緩艾美耳球蟲(chóng)激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的特征

IFN-γ的分泌是T細(xì)胞活化的標(biāo)志之一，特異性抗原刺激下T細(xì)胞活化的數(shù)目是反映針對(duì)該抗原細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度的重要指征 (Yinetal., 2013)。本研究利用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)雞群免疫后外周血淋巴細(xì)胞在球蟲(chóng)特異性抗原刺激下，分泌IFN-γ淋巴細(xì)胞的數(shù)量，反映球蟲(chóng)激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。結(jié)果顯示，免疫后雞群外周血分泌IFN-γ特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量約為80，而未免疫組的6只雞中，只有2只檢測(cè)到數(shù)量極少的斑點(diǎn)(分別檢測(cè)到3個(gè)斑點(diǎn)、9個(gè)斑點(diǎn))(圖4)，說(shuō)明和緩艾美耳球蟲(chóng)免疫后，外周血中特異性淋巴細(xì)胞大量增殖，反映出和緩艾美耳球蟲(chóng)能夠激發(fā)宿主較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3 討論

本研究中，免疫雞群后卵囊排出量顯示了和緩艾美耳球蟲(chóng)涿州株具備良好的免疫原性，且和緩艾美耳能激發(fā)宿主產(chǎn)生較低水平的血清抗體及較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，初步揭示和緩艾美耳球蟲(chóng)具備良好免疫原性的基礎(chǔ)是由于其激發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖4 二次免疫后外周血淋巴細(xì)胞中特異性分泌IFN-γ淋巴細(xì)胞的數(shù)量Fig. 4 IFN-γ secretion cell population in PBMCs post the 2nd immunization with E. mitis 14 days第2次免疫后14 d，分離雞外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，PBS、和緩艾美耳球蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原、PMA+離子霉素刺激24小時(shí)后(A、B、C)檢測(cè)IFN-γ的分泌水平(左側(cè)為免疫組，右側(cè)為對(duì)照組)。各試驗(yàn)組隨機(jī)選取6只雞進(jìn)行IFN-γ分泌水平的檢測(cè)，D圖示各組IFN-γ分泌水平的平均值。IFN-γsecretion cell population in PBMCs post the second immunization with E. mitis 14 days was detected by ELISPOT. The IFN-γsecretion was detected followed by stimulated with PBS, E. mitis antigen and PMA (A, B and C, respectively) about 24 h. D. The average spots of each group was obtained from 6 birds.

和緩艾美耳球蟲(chóng)激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平個(gè)體間存在差異的可能原因有兩方面，一是本研究中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是AA肉雞，屬遠(yuǎn)交系群體，個(gè)體差異較大，對(duì)病原感染的反應(yīng)性差異也較大(Zhouetal., 2010)；二是IFN-γ的分泌水平只能部分反應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，即從免疫應(yīng)答的量來(lái)反應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，而免疫應(yīng)答的質(zhì)(如多功能T細(xì)胞的數(shù)量)往往是保護(hù)性免疫應(yīng)答的決定因素，這可能出現(xiàn)IFN-γ分泌較少但I(xiàn)FN-γ+TNF-α+IL2+T細(xì)胞的比例、T細(xì)胞的增殖能力和對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)控能力(通過(guò)分泌趨化因子)、CTL細(xì)胞的殺傷能力以及中和抗體的親和力等較高的群體免疫保護(hù)力反而較高(Sederetal., 2008)。因此，深入研究球蟲(chóng)激發(fā)宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答的全貌應(yīng)綜合分析其激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的量和質(zhì)(Sederetal., 2008)。

和緩艾美耳球蟲(chóng)具備良好的免疫原性，能激發(fā)宿主較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但其激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度低于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)。同等劑量、相同的免疫程序，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)二免后每106外周血單核細(xì)胞中分泌IFN-γ特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量為120左右(Yinetal., 2013)，而和緩艾美耳球蟲(chóng)為80左右(圖4-D)?？赡艿慕忉屖?，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)寄生于盲腸，感染時(shí)能大量招募盲腸扁桃體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，球蟲(chóng)抗原能迅速被識(shí)別和遞呈至機(jī)體免疫系統(tǒng)，繼而激發(fā)宿主較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答(Chapmanetal., 2013)，而和緩艾美耳球蟲(chóng)裂殖生殖主要在小腸后段進(jìn)行，第3代裂殖生殖和配子生殖亦在盲腸部位進(jìn)行，小腸后段淋巴組織分布相對(duì)較少(McDonaldetal., 1984; Novillaetal., 1987)盲腸扁桃體識(shí)別對(duì)和緩艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行抗原識(shí)別與遞呈局限于裂殖生殖后期與配子生殖，故激發(fā)的免疫應(yīng)答相對(duì)較弱。

本研究初步揭示了和緩艾美耳球蟲(chóng)激發(fā)宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答的特征，為解釋其具備良好免疫原性及研究宿主抗和緩艾美耳球蟲(chóng)感染的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同樣，和緩艾美耳球蟲(chóng)作為球蟲(chóng)病疫苗的組分之一，尚需深入研究其激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的全貌，進(jìn)一步揭示球蟲(chóng)病疫苗提供堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)免疫應(yīng)答的機(jī)理。