李 超 汪運舟 陶鴿如 王 丹 焦雅清 顧小龍 索 勛 劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

兔球蟲病是家兔感染一種或數(shù)種艾美耳屬兔球蟲后引起的一類寄生性原蟲病，感染率高，幼兔感染率高達90%以上(崔平等，2010)，危害大，尤其對斷奶至3月齡仔兔影響嚴重，主要引起腹瀉、消瘦、生長緩慢等癥狀，嚴重時可導(dǎo)致死亡，每年給養(yǎng)兔業(yè)帶來重大損失(Sherkovetal., 1986)。

目前世界公認的兔球蟲有11個種，主要致病蟲種為：腸艾美耳球蟲Eimeriaintestinalis、黃艾美耳球蟲E.flavescens、大型艾美耳球蟲E.magna和斯氏艾美耳球蟲E.stiedai(Pakandl, 2009)。我國的兩次兔球蟲病流行病學(xué)調(diào)查指出，家兔的腸艾美耳球蟲平均感染率分別為21.25%(張龍現(xiàn)等, 1999)和14.8% (Jingetal., 2012)，屬于較高水平。已有研究表明，腸艾美耳球蟲屬于高致病性蟲種， 5×103個卵囊感染即可使仔兔發(fā)病，導(dǎo)致半數(shù)死亡(Coudertetal., 1993)；有報道，人工感染家兔1×105個以上卵囊可導(dǎo)致其出現(xiàn)嚴重臨床癥狀(殷佩云等，1990)；而Shi等(2014)的研究則表明，接種5×103浙江株卵囊未見明顯的臨床癥狀，且免疫原性也弱于之前的報道。

鑒于這種地方分離株在生物學(xué)特性上的差異，我們對腸艾美耳球蟲張家口分離株的致病性和免疫原性進行了研究，可為今后的兔球蟲病疫苗的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵囊

我們從張家口一兔場利用單卵囊分離技術(shù)，獲得了純種腸艾美耳球蟲，收集9～12 d的卵囊并使其孢子化(在搖床上，卵囊懸于2.5%重鉻酸鉀溶液中，轉(zhuǎn)速為100 r/min，與空氣充分接觸，26 ℃，60 h)。在顯微鏡下觀察其形態(tài)，包括形狀、有無卵膜孔、有無內(nèi)外殘體，并測量大小(n=100)。將1 000個該株孢子化卵囊口服接種無球蟲兔，獲得大量卵囊，用于致病性和免疫原性實驗。

1.2 實驗動物

35～45日齡無球蟲新西蘭大白兔(雌雄各半，體重800～1 000 g)，均來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州實驗基地?zé)o球蟲兔繁育場。實驗兔均飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)、照明充足的無球蟲兔舍，并且在實驗前經(jīng)糞便檢查確保無球蟲感染。實驗兔均單籠飼養(yǎng)，可自由采食飲水。

1.3 實驗設(shè)計

20只無球蟲兔隨機分為5組，每組4只。第1組為空白對照組，實驗全程不接種球蟲，并飼喂添加抗球蟲藥物的飼料(莫能菌素20 mg/kg和地克珠利1 mg/kg；第2、3、4組為攻蟲組，每只分別口服接種腸艾美耳球蟲孢子化卵囊1×104、1×105、1×106個；第5組為攻毒對照組，不接種球蟲。接種后， 0、7、14和21 d稱重；7 d開始，每天觀察家兔臨床癥狀，7 d清糞，10、14和21 d采集糞樣，并稱量糞便總重，以進行卵囊檢測。21 d后，第2、3、4、5組分別接種1×106個腸艾美耳球蟲進行攻毒，并持續(xù)觀察21 d，每天記錄臨床癥狀，攻毒后0、7、14和21 d進行體重稱量和糞便采集。每次采集糞樣后，用麥克馬氏法進行卵囊計數(shù)(索勛等，1998)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析。

2 結(jié)果

2.1 腸艾美耳球蟲張家口分離株的鑒定

在40倍顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)鑒定，卵囊均呈梨形，尖端有明顯的卵膜孔，卵囊內(nèi)有4個孢子囊和1個外殘體，每個孢子囊內(nèi)有2個子孢子和1個內(nèi)殘體，每個子孢子內(nèi)有1個折光體；卵囊長寬大小均在(27.0～32.0)μm×(17.0～20.0)μm范圍內(nèi)(n=100)，與文獻描述吻合(Eckertetal.，1995)，表明所分離的是純種腸艾美耳球蟲，命名為腸艾美耳球蟲張家口分離株(圖1)。

圖1 腸艾美耳球蟲張家口分離株孢子化卵囊 (標尺長度為20 μm)Fig. 1 Sporulated oocysts of Eimeria intestinalis, ZJK isolate (bar=20 μm)

2.2 腸艾美耳球蟲張家口分離株致病性測定

2.2.1 臨床癥狀：第2、3、4組實驗兔接種后第8 d開始，均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、厭食等癥狀；9 d后第3、4組所有實驗兔和第2組兩只實驗兔出現(xiàn)腹瀉；14 d后，第3組死亡1只，第4組死亡2只。死后剖檢均發(fā)現(xiàn)腸壁增厚，腸道有明顯出血，確定為球蟲感染所致。接種后14～21 d，耐受個體臨床癥狀逐漸消失，食欲、精神狀況逐漸恢復(fù)。

2.2.2 體重變化：實驗期間，空白對照組平均日增重始終保持穩(wěn)定，達到31～39 g；接種后7 d即腸艾美耳球蟲潛隱期內(nèi)，除第4組體重略有降低外，其余各組體重增長水平與空白對照組無差異；接種后7～14 d，第2、3、4組平均日增重均有大幅下降，且第3、4組更為明顯；接種后14～21 d，第4組體重下降幅度明顯降低；第3組體重開始增長，而第2組則表現(xiàn)體重的迅速代償，日增重超過空白對照組(表1)。由此可見，腸艾美耳球蟲張家口分離株能夠使家兔致

表 1 初次接種后平均日增重的變化Tab. 1 Mean daily weight gain after first inoculation

使用one-way ANOVA法進行多組間差異性分析，平均值(平均值±標準差)上標字母表示差異性顯著(P<0.05,n=4)； dpi：接種后天數(shù)。下同。

One-way ANOVA test for significant difference test，means (M±S.D.)with different superscript are significant different；dpi: days post inoculation. The same below.

病：接種1×104個卵囊即可導(dǎo)致明顯的體重下降，影響生產(chǎn)性能；超過1×105個卵囊的感染可能導(dǎo)致家兔死亡。

2.2.3 卵囊排出量：初次接種后8 d開始，第2、3、4組家兔均排出大量卵囊，接種后11～14 d達到高峰，18 d之后逐減少。隨著接種劑量的增加，卵囊排出量也增加。其中第4組家兔卵囊排出總量最大，高峰時期(接種后11～14 d)，平均每只兔可排出卵囊5×108以上(表2)。

表2 初次接種后各組兔平均排卵囊量Tab. 2 Oocyst output per rabbit after first inoculation

2.3 腸艾美耳球蟲張家口分離株免疫原性測定

為驗證腸艾美耳球蟲張家口分離株的免疫原性，我們對第2、3、4組實驗兔再次接種1×106個卵囊，第5組作為攻毒對照組，同樣接種1×106個卵囊。監(jiān)測實驗兔臨床病變、日增重變化、卵囊排出量。

2.3.1 臨床癥狀：攻毒后，免疫組(第2、3、4組)均未出現(xiàn)臨床癥狀；而攻毒對照組(第5組)則在第7 d開始出現(xiàn)精神沉郁、腹瀉、厭食等癥狀，且生長嚴重停滯，18 d后逐漸恢復(fù)?？瞻讓φ战M(第1組)生長良好。

2.3.2 體重變化：攻毒后，免疫組實驗兔日增重均未受到影響，表明機體已建立了有效的免疫保護(表3)。其中，第3、4組與空白對照組(第1組)相比無顯著差異，而第2組日增重水平則高于第1組，出現(xiàn)了一定程度的生長代償。攻毒對照組的體重則出現(xiàn)了明顯降低。

2.3.3 卵囊排出量：攻毒后，免疫組的卵囊排出量均為1×106左右，較攻毒對照組顯著減少，減少率均在99%以上；同時也遠低于第一次接種后卵囊排出量，攻毒對照組家兔則排出超過1×108個卵囊(表4)。

3 討論

本文對腸艾美耳球蟲張家口分離株的致病性及免疫原性進行了初步研究。結(jié)果表明，感染1×104個腸艾美耳球蟲孢子化卵囊可引起明顯臨床癥狀，體增重受到抑制，更高劑量的感染則會導(dǎo)致家兔死亡；同時腸艾美耳球蟲具有良好的免疫原性，初次感染可激發(fā)良好的保護性免疫應(yīng)答，從而抵抗再次感染。

表3 攻毒后各組兔平均日增重的變化Tab. 3 Mean daily weight gain after challenge

臨床癥狀、體重變化以及死亡率是衡量兔球蟲致病性的主要標準。之前的研究表明腸艾美耳球蟲致病力較強，半數(shù)致死量為5×103個卵囊(Coudertetal., 1993)；有研究也表明腸艾美耳球蟲感染后能夠引發(fā)嚴重的臨床癥狀，家兔生產(chǎn)性能受到極大抑制(Shietal., 2014)。

表4 攻毒后后各組兔平均排卵囊量Tab. 4 Oocyst output per rabbit after challenge

本研究中，張家口分離株致病性稍弱，1×105才能引起個別家兔死亡，但是引起的臨床病變和體重降低同樣十分明顯，表明了該分離株對生產(chǎn)有著一定的危害，致病性為中等。實驗中還發(fā)現(xiàn)，1×104個卵囊感染后第3周，實驗兔日增重水平可快速恢復(fù)，表明非致死劑量感染后，家兔能夠較為明顯的代償，這就提示將來活卵囊疫苗應(yīng)用可能會得到相同的效果，為今后的疫苗研究提供了保證。

腸艾美耳球蟲具有優(yōu)秀的免疫原性，6個卵囊的免疫就足以減輕攻毒后的臨床表現(xiàn)，而6×102或更多的卵囊，則可提供完全保護(Coudertetal., 1993)；腸艾美耳球蟲浙江株的初次感染能夠為動物提供足夠的免疫保護(Shietal., 2014)。本實驗中，攻毒后免疫組均未表現(xiàn)出臨床癥狀，卵囊排出減少90%以上，表明該株與前人報道相似，同樣具有良好的免疫原性，再次證明了腸艾美耳球蟲進行免疫手段預(yù)防的可行性。

活卵囊疫苗是球蟲病疫苗開發(fā)的趨勢，但免疫的同時可能會對家兔的健康和生產(chǎn)性能造成影響，因此利用弱毒蟲株是解決該問題的最佳手段。目前國外已經(jīng)成功地選育出腸艾美耳球蟲早熟株，能夠在保留良好免疫原性的同時降低其毒力(Licoisetal., 1990)。而國內(nèi)尚無兔球蟲早熟選育成功的報道，疫苗研究相對落后。本實驗證實了腸艾美耳球蟲張家口分離株具有較強的致病性良好的免疫原性，因此有進行早熟選育的必要，以使其成為未來兔球蟲病疫苗的的組分之一。