張德太, 左曙蓉, 楊 文, 石伍和, 涂啟明, 梁 濤, 張 科
(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科,湖北武漢430022)
轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase,TKT)是葡萄糖磷酸戊糖途徑非氧化支路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,轉(zhuǎn)酮醇酶樣基因-1(transketolase-like gene 1,TKTL1)是轉(zhuǎn)酮醇酶基因家族中的重要成員。研究表明,許多惡性腫瘤TKTL1表達顯著上調(diào)[1-3],其表達水平與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。無論如何,僅從TKTL1所具備的催化功能是難以解釋其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。研究表明,轉(zhuǎn)染過表達腫瘤細胞TKTL1表達能顯著上調(diào)低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)表達水平[6]。我們新近通過抑制肝癌細胞TKTL1表達后發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境及糖酵解終產(chǎn)物的生成均發(fā)生顯著改變[7]。綜上所述,我們推測腫瘤細胞TKTL1是否能通過HIF-1α影響糖酵解并對腫瘤細胞惡性進展發(fā)揮調(diào)控作用呢?為此,本文將重點研究siRNA沉默TKTL1后對HIF-1α表達及糖酵解關(guān)鍵酶活性的影響。
1.1 細胞株 菌株和細胞質(zhì)粒pEGFP-C1-U6及大腸桿菌DH5α均購自武漢晶賽公司,人宮頸癌HeLa細胞株購自中國科學院細胞庫。
1.2 試劑 T4 DNA Ligase、BamH I、Hind III、Sal I和Pst I均為NEB產(chǎn)品,瓊脂糖膠回收試劑盒為日本TaKaRa產(chǎn)品,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 LipofectamineTM2000購自Invitrogen,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等均購自Promega,質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司,胎牛血清購自Gibco,兔抗人HIF-1α抗體購自R&D,兔抗人己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ,HK-Ⅱ)多克隆抗體購自Chemicon,兔抗人GAPDH抗體和蛋白質(zhì)印跡化學發(fā)光檢測試劑盒購自Santa Cruz,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgGⅡ抗購于武漢博士德公司,PVDF膜購自PALL,D-5-磷酸核糖二鈉鹽、5-磷酸木酮糖、磷酸甘油醛異構(gòu)酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等均購自Sigma;蛋白測定試劑盒、HK-Ⅱ測定試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定試劑盒均購自南京建成生物公司,其它化學試劑為國產(chǎn)。
1.3 儀器 引物設(shè)計軟件為Primer 5.0,PCR儀為Applied Biosystem產(chǎn)品,電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品,可見-紫外分光光度計為Shimadzu產(chǎn)品,超聲粉碎勻漿器由寧波新芝科器研究所生產(chǎn)。
2.1 細胞培養(yǎng)及低氧處理 人宮頸癌HeLa細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),每2~3 d傳代1次,傳代時用0.25%胰蛋白酶(含0.1%EDTA)進行消化。細胞生長至次融合狀態(tài)時進行低氧處理:以去氣泡培養(yǎng)液換液,置細胞于充入5%CO2及90%氮氣(氧氣濃度為5%)的37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)36 h。
2.2 載體的構(gòu)建及鑒定 參照文獻[8],將pEGFPC1-U6和合成的TKTL1 siRNA用雙酶切消化,低融點瓊脂糖凝膠電泳后回收大片段;回收片段用T4連接酶連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,涂布于含卡那霉素抗性的LB平皿上,37℃恒溫過夜,挑選單克隆菌落于含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中,37℃、270 r/min搖床培養(yǎng)過夜;用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒,并做酶切與測序鑒定。
2.3 重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞及陽性細胞克隆的篩選 參照文獻[8],應(yīng)用 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體載體介導方法將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-U6/TKTL1轉(zhuǎn)染至HeLa細胞。細胞用胰酶消化、計數(shù),取2個6孔板鋪板:1~3孔為轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-U6/TKTL1質(zhì)粒的HeLa細胞(轉(zhuǎn)染組),4~6孔為轉(zhuǎn)染 pEGFP-C1-U6/UC質(zhì)粒的細胞(質(zhì)粒對照組),7~9孔為未做任何轉(zhuǎn)染處理的細胞(未轉(zhuǎn)染組)。轉(zhuǎn)染48 h后,采用G418進行逐步篩選,篩選8周后獲得穩(wěn)定克隆。
2.4 轉(zhuǎn)染細胞mRNA表達的檢測 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞在缺氧環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)36 h,收集細胞并以冷PBS清洗后采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA,用Oligo(dT)18及M-MLV將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增,TKTL1上游引物為5’-TAACACCATGACGCC-3’,下游引物為 5’-CATCCTAACAAGCTTTCGCTG-3’,擴增產(chǎn)物為150 bp;GAPDH上游引物為 5’-GAAGGTGAAGGTCGGATGC-3’,下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’,擴增產(chǎn)物為 226 bp;擴增條件為94 ℃ 45 s,59 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s。
2.5 轉(zhuǎn)染細胞蛋白表達的檢測 參照文獻[9],分別將轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對照組和未轉(zhuǎn)染組的HeLa細胞進行缺氧培養(yǎng)36 h,收集細胞離心去上清,以冷PBS洗滌2次。細胞沉淀用細胞裂解緩沖液重懸,置冰上搖床30 min后,12 000 r/min離心取上清進行蛋白定量。取蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離總蛋白,以半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。膜用含5%脫脂奶的PBST室溫孵育1 h后分別加入兔抗人HIF-1α多克隆抗體、兔抗人HK-Ⅱ多克隆抗體和GAPDHⅠ抗,4℃雜交過夜。次日洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgGⅡ抗,室溫孵育1 h,TBS漂洗,應(yīng)用ECL試劑盒行發(fā)光反應(yīng),圖像掃描分析。
2.6 細胞內(nèi)TKT、HK-Ⅱ及LDH活性測定 將穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞在缺氧條件下連續(xù)培養(yǎng)36 h,收集細胞并以冷PBS清洗后在冷裂解緩沖液中0℃裂解30 min,10 000 r/min離心15 min。取上清采用Bradford法進行蛋白定量;參照文獻[10]用動態(tài)速率法測定TKT活性,單位用每分鐘生成產(chǎn)物的量(μg)與細胞總蛋白(g)的比值來表示;按照試劑盒說明書測定HK-Ⅱ及LDH活性,單位用103U/g蛋白表示。實驗均重復3次。
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,使用SPSS 10.01統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對照組和未轉(zhuǎn)染組的HeLa細胞培養(yǎng)36 h后提取RNA,RT-PCR檢測TKTL1 mRNA表達水平,同時測定細胞內(nèi)TKT活性。將未轉(zhuǎn)染組細胞TKTL1與GAPDH mRNA表達之比設(shè)為1.0,siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因后,其表達下降達60%左右,見圖1。siRNA沉默TKTL1基因后其TKT活性與未轉(zhuǎn)染組和質(zhì)粒對照組比較顯著下降(P<0.01),質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組TKT活性無明顯差異,見圖2。
siRNA沉默TKTL1基因的HeLa細胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h后經(jīng)Western blotting檢測,HIF-1α蛋白表達水平較未轉(zhuǎn)染組細胞有顯著下降,質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間HIF-1α表達無明顯差異,見圖3。
Figure 1.Effect of RNA interference on TKTL1 mRNA expression in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.**P <0.01 vs non-transfection.圖1 siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因?qū)ζ鋗RNA表達的影響
Figure 2.Effect of RNA interference on TKT activiy in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3. **P <0.01 vs non-transfection.圖2 siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因?qū)KT活性的影響
Figure 3.Effect of RNA interference on HIF-1α protein expression.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3. **P <0.01 vs non-transfection.圖3 TKTL1沉默對HIF-1α蛋白表達的影響
siRNA沉默TKTL1基因后,在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的HeLa細胞HK-Ⅱ蛋白表達較未轉(zhuǎn)染組顯著下降,質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間HK-Ⅱ蛋白表達無顯著差異,見圖4。
Figure 4.Effect of RNA interference on HK-Ⅱprotein expression.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.**P< 0.01 vs non-transfection.圖4 TKTL1沉默對HK-Ⅱ蛋白表達的影響
以未轉(zhuǎn)染組HeLa細胞內(nèi)HK-Ⅱ活性為參照,siRNA沉默TKTL1基因后胞內(nèi)HK-Ⅱ活性較未轉(zhuǎn)染組細胞有顯著下降(P<0.01),而質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間HK-Ⅱ活性無明顯差異,見圖5。
Figure 5.Effect of RNA interference on HK-Ⅱactivity in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.**P< 0.01 vs non-transfection.圖5 siRNA沉默TKTL1基因?qū)eLa細胞HK-Ⅱ活性的影響
siRNA沉默TKTL1基因后HeLa細胞內(nèi)LDH活性較未轉(zhuǎn)染組細胞有顯著下降(P<0.01),而質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間LDH活性無明顯差異,見圖6。
Figure 6.Effect of RNA interference on LDH activity in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.**P< 0.01 vs non-transfection.圖6 siRNA沉默TKTL1基因?qū)eLa細胞LDH活性的影響
腫瘤細胞TKT活性升高主要依賴TKTL1高表達,從而為腫瘤細胞大量增殖提供足夠的核酸合成原料。近年來,大量臨床研究表明,TKTL1高表達往往與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān),TKTL1高表達往往提示腫瘤細胞具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移潛能、預(yù)后不良,因而人們開始關(guān)注TKTL1與腫瘤惡性表型的關(guān)系并試圖揭示其內(nèi)在機制。Wenyue等[6]轉(zhuǎn)染TKTL1過表達質(zhì)粒到頭頸鱗癌細胞系JHU-O11后發(fā)現(xiàn)細胞增殖加快,HIF-1α mRNA及蛋白水平均明顯升高。我們在肝癌細胞HepG2中通過siRNA沉默TKTL1后發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境及糖酵解終產(chǎn)物(乳酸)的生成均發(fā)生明顯變化[7],因此,我們推測腫瘤細胞高表達的TKTL1可能通過HIF-1α間接影響葡萄糖酵解代謝途徑。
本研究結(jié)果表明,通過siRNA技術(shù)沉默HeLa細胞TKTL1基因后,TKTL1 mRNA表達下降60%左右,TKT活性亦明顯下降。十分有意義的是發(fā)現(xiàn)TKTL1基因表達抑制后在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的HeLa細胞HIF-1α蛋白水平也出現(xiàn)明顯下降,結(jié)合Wenyue等的結(jié)果,我們認為腫瘤細胞能通過TKTL1調(diào)控其在缺氧狀態(tài)下 HIF-1α的表達,即 TKTL1高表達時HIF-1α表達上調(diào),反之則下調(diào)。鑒于HIF-1是缺氧條件下哺乳動物體內(nèi)的廣泛轉(zhuǎn)錄因子,與腫瘤關(guān)系密切,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用從而使腫瘤細胞能適應(yīng)低氧的微環(huán)境,促進腫瘤血管的再生和細胞能量代謝[11-12]。
糖酵解途徑是腫瘤細胞獲取能量的主要方式,HK是糖酵解的第1個限速酶,人類細胞有4種HK亞型,其中HK-II在惡性腫瘤細胞中高表達,和腫瘤的關(guān)系最密切[13]。LDH是生物中普遍存在的一種酶,由3個亞基分別形成4種同工酶,催化丙酮酸生成乳酸,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。本文研究結(jié)果顯示,通過siRNA技術(shù)沉默TKTL1基因后,在缺氧條件下培養(yǎng)的HeLa細胞不僅HIF-1α蛋白水平明顯下降,糖酵解的關(guān)鍵蛋白HK-II表達下調(diào),LDH活性顯著下降。糖酵解途徑代謝的下調(diào)必然影響腫瘤細胞能量代謝、合成代謝及微環(huán)境的改變,最終導致腫瘤惡性特質(zhì)的改變,這可能就是腫瘤細胞TKTL1高表達往往預(yù)示侵襲轉(zhuǎn)移與預(yù)后不良的重要原因之一。至于TKTL1是如何影響HIF-1α表達及其內(nèi)在相互作用的分子機制目前尚不清楚,有待進一步研究。
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