張德太， 左曙蓉， 楊 文， 石伍和， 涂啟明， 梁 濤， 張 科

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，湖北武漢430022)

轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase，TKT)是葡萄糖磷酸戊糖途徑非氧化支路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，轉(zhuǎn)酮醇酶樣基因-1(transketolase-like gene 1，TKTL1)是轉(zhuǎn)酮醇酶基因家族中的重要成員。研究表明，許多惡性腫瘤TKTL1表達顯著上調(diào)［1-3］，其表達水平與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［4-5］。無論如何，僅從TKTL1所具備的催化功能是難以解釋其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。研究表明，轉(zhuǎn)染過表達腫瘤細胞TKTL1表達能顯著上調(diào)低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)表達水平［6］。我們新近通過抑制肝癌細胞TKTL1表達后發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境及糖酵解終產(chǎn)物的生成均發(fā)生顯著改變［7］。綜上所述，我們推測腫瘤細胞TKTL1是否能通過HIF-1α影響糖酵解并對腫瘤細胞惡性進展發(fā)揮調(diào)控作用呢?為此，本文將重點研究siRNA沉默TKTL1后對HIF-1α表達及糖酵解關(guān)鍵酶活性的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株 菌株和細胞質(zhì)粒pEGFP-C1-U6及大腸桿菌DH5α均購自武漢晶賽公司，人宮頸癌HeLa細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.2 試劑 T4 DNA Ligase、BamH I、Hind III、Sal I和Pst I均為NEB產(chǎn)品，瓊脂糖膠回收試劑盒為日本TaKaRa產(chǎn)品，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 LipofectamineTM2000購自Invitrogen，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等均購自Promega，質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，胎牛血清購自Gibco，兔抗人HIF-1α抗體購自R＆D，兔抗人己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK-Ⅱ)多克隆抗體購自Chemicon，兔抗人GAPDH抗體和蛋白質(zhì)印跡化學發(fā)光檢測試劑盒購自Santa Cruz，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgGⅡ抗購于武漢博士德公司，PVDF膜購自PALL，D-5-磷酸核糖二鈉鹽、5-磷酸木酮糖、磷酸甘油醛異構(gòu)酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等均購自Sigma;蛋白測定試劑盒、HK-Ⅱ測定試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒均購自南京建成生物公司，其它化學試劑為國產(chǎn)。

1.3 儀器 引物設(shè)計軟件為Primer 5.0，PCR儀為Applied Biosystem產(chǎn)品，電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品，可見-紫外分光光度計為Shimadzu產(chǎn)品，超聲粉碎勻漿器由寧波新芝科器研究所生產(chǎn)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及低氧處理 人宮頸癌HeLa細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，傳代時用0.25%胰蛋白酶(含0.1%EDTA)進行消化。細胞生長至次融合狀態(tài)時進行低氧處理:以去氣泡培養(yǎng)液換液，置細胞于充入5%CO2及90%氮氣(氧氣濃度為5%)的37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)36 h。

2.2 載體的構(gòu)建及鑒定 參照文獻［8］，將pEGFPC1-U6和合成的TKTL1 siRNA用雙酶切消化，低融點瓊脂糖凝膠電泳后回收大片段;回收片段用T4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB平皿上，37℃恒溫過夜，挑選單克隆菌落于含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃、270 r/min搖床培養(yǎng)過夜;用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，并做酶切與測序鑒定。

2.3 重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞及陽性細胞克隆的篩選 參照文獻［8］，應(yīng)用 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體載體介導方法將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-U6/TKTL1轉(zhuǎn)染至HeLa細胞。細胞用胰酶消化、計數(shù)，取2個6孔板鋪板:1～3孔為轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-U6/TKTL1質(zhì)粒的HeLa細胞(轉(zhuǎn)染組)，4～6孔為轉(zhuǎn)染 pEGFP-C1-U6/UC質(zhì)粒的細胞(質(zhì)粒對照組)，7～9孔為未做任何轉(zhuǎn)染處理的細胞(未轉(zhuǎn)染組)。轉(zhuǎn)染48 h后，采用G418進行逐步篩選，篩選8周后獲得穩(wěn)定克隆。

2.4 轉(zhuǎn)染細胞mRNA表達的檢測 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞在缺氧環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細胞并以冷PBS清洗后采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，用Oligo(dT)18及M-MLV將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增，TKTL1上游引物為5’-TAACACCATGACGCC-3’，下游引物為 5’-CATCCTAACAAGCTTTCGCTG-3’，擴增產(chǎn)物為150 bp;GAPDH上游引物為 5’-GAAGGTGAAGGTCGGATGC-3’，下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，擴增產(chǎn)物為 226 bp;擴增條件為94 ℃ 45 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s。

2.5 轉(zhuǎn)染細胞蛋白表達的檢測 參照文獻［9］，分別將轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對照組和未轉(zhuǎn)染組的HeLa細胞進行缺氧培養(yǎng)36 h，收集細胞離心去上清，以冷PBS洗滌2次。細胞沉淀用細胞裂解緩沖液重懸，置冰上搖床30 min后，12 000 r/min離心取上清進行蛋白定量。取蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離總蛋白，以半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。膜用含5%脫脂奶的PBST室溫孵育1 h后分別加入兔抗人HIF-1α多克隆抗體、兔抗人HK-Ⅱ多克隆抗體和GAPDHⅠ抗，4℃雜交過夜。次日洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgGⅡ抗，室溫孵育1 h，TBS漂洗，應(yīng)用ECL試劑盒行發(fā)光反應(yīng)，圖像掃描分析。

2.6 細胞內(nèi)TKT、HK-Ⅱ及LDH活性測定 將穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞在缺氧條件下連續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細胞并以冷PBS清洗后在冷裂解緩沖液中0℃裂解30 min，10 000 r/min離心15 min。取上清采用Bradford法進行蛋白定量;參照文獻［10］用動態(tài)速率法測定TKT活性，單位用每分鐘生成產(chǎn)物的量(μg)與細胞總蛋白(g)的比值來表示;按照試劑盒說明書測定HK-Ⅱ及LDH活性，單位用103U/g蛋白表示。實驗均重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 10.01統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1s iRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因后其mRNA表達及TKT活性的變化

siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對照組和未轉(zhuǎn)染組的HeLa細胞培養(yǎng)36 h后提取RNA，RT-PCR檢測TKTL1 mRNA表達水平，同時測定細胞內(nèi)TKT活性。將未轉(zhuǎn)染組細胞TKTL1與GAPDH mRNA表達之比設(shè)為1.0，siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因后，其表達下降達60%左右，見圖1。siRNA沉默TKTL1基因后其TKT活性與未轉(zhuǎn)染組和質(zhì)粒對照組比較顯著下降(P＜0.01)，質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組TKT活性無明顯差異，見圖2。

2 siRNA沉默TKTL1基因?qū)?HeLa細胞HIF-1α蛋白表達的影響

siRNA沉默TKTL1基因的HeLa細胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h后經(jīng)Western blotting檢測，HIF-1α蛋白表達水平較未轉(zhuǎn)染組細胞有顯著下降，質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間HIF-1α表達無明顯差異，見圖3。

Figure 1.Effect of RNA interference on TKTL1 mRNA expression in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs non-transfection.圖1 siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因?qū)ζ鋗RNA表達的影響

Figure 2.Effect of RNA interference on TKT activiy in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs non-transfection.圖2 siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因?qū)KT活性的影響

Figure 3.Effect of RNA interference on HIF-1α protein expression.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs non-transfection.圖3 TKTL1沉默對HIF-1α蛋白表達的影響

3 siRNA沉默TKTL1基因?qū)eLa細胞HK-Ⅱ蛋白表達的影響

siRNA沉默TKTL1基因后，在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的HeLa細胞HK-Ⅱ蛋白表達較未轉(zhuǎn)染組顯著下降，質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間HK-Ⅱ蛋白表達無顯著差異，見圖4。

Figure 4.Effect of RNA interference on HK-Ⅱprotein expression.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.＊＊P＜ 0.01 vs non-transfection.圖4 TKTL1沉默對HK-Ⅱ蛋白表達的影響

4 siRNA沉默TKTL1基因?qū)eLa細胞HK-Ⅱ活性的影響

以未轉(zhuǎn)染組HeLa細胞內(nèi)HK-Ⅱ活性為參照，siRNA沉默TKTL1基因后胞內(nèi)HK-Ⅱ活性較未轉(zhuǎn)染組細胞有顯著下降(P＜0.01)，而質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間HK-Ⅱ活性無明顯差異，見圖5。

Figure 5.Effect of RNA interference on HK-Ⅱactivity in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.＊＊P＜ 0.01 vs non-transfection.圖5 siRNA沉默TKTL1基因?qū)eLa細胞HK-Ⅱ活性的影響

5 siRNA沉默HeLa細胞TKTL1基因下調(diào)LDH活性

siRNA沉默TKTL1基因后HeLa細胞內(nèi)LDH活性較未轉(zhuǎn)染組細胞有顯著下降(P＜0.01)，而質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染組之間LDH活性無明顯差異，見圖6。

Figure 6.Effect of RNA interference on LDH activity in HeLa cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.Mean±SD.n=3.＊＊P＜ 0.01 vs non-transfection.圖6 siRNA沉默TKTL1基因?qū)eLa細胞LDH活性的影響

討 論

腫瘤細胞TKT活性升高主要依賴TKTL1高表達，從而為腫瘤細胞大量增殖提供足夠的核酸合成原料。近年來，大量臨床研究表明，TKTL1高表達往往與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)，TKTL1高表達往往提示腫瘤細胞具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移潛能、預(yù)后不良，因而人們開始關(guān)注TKTL1與腫瘤惡性表型的關(guān)系并試圖揭示其內(nèi)在機制。Wenyue等［6］轉(zhuǎn)染TKTL1過表達質(zhì)粒到頭頸鱗癌細胞系JHU-O11后發(fā)現(xiàn)細胞增殖加快，HIF-1α mRNA及蛋白水平均明顯升高。我們在肝癌細胞HepG2中通過siRNA沉默TKTL1后發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境及糖酵解終產(chǎn)物(乳酸)的生成均發(fā)生明顯變化［7］，因此，我們推測腫瘤細胞高表達的TKTL1可能通過HIF-1α間接影響葡萄糖酵解代謝途徑。

本研究結(jié)果表明，通過siRNA技術(shù)沉默HeLa細胞TKTL1基因后，TKTL1 mRNA表達下降60%左右，TKT活性亦明顯下降。十分有意義的是發(fā)現(xiàn)TKTL1基因表達抑制后在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的HeLa細胞HIF-1α蛋白水平也出現(xiàn)明顯下降，結(jié)合Wenyue等的結(jié)果，我們認為腫瘤細胞能通過TKTL1調(diào)控其在缺氧狀態(tài)下 HIF-1α的表達，即 TKTL1高表達時HIF-1α表達上調(diào)，反之則下調(diào)。鑒于HIF-1是缺氧條件下哺乳動物體內(nèi)的廣泛轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤關(guān)系密切，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用從而使腫瘤細胞能適應(yīng)低氧的微環(huán)境，促進腫瘤血管的再生和細胞能量代謝［11-12］。

糖酵解途徑是腫瘤細胞獲取能量的主要方式，HK是糖酵解的第1個限速酶，人類細胞有4種HK亞型，其中HK-II在惡性腫瘤細胞中高表達，和腫瘤的關(guān)系最密切［13］。LDH是生物中普遍存在的一種酶，由3個亞基分別形成4種同工酶，催化丙酮酸生成乳酸，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［14］。本文研究結(jié)果顯示，通過siRNA技術(shù)沉默TKTL1基因后，在缺氧條件下培養(yǎng)的HeLa細胞不僅HIF-1α蛋白水平明顯下降，糖酵解的關(guān)鍵蛋白HK-II表達下調(diào)，LDH活性顯著下降。糖酵解途徑代謝的下調(diào)必然影響腫瘤細胞能量代謝、合成代謝及微環(huán)境的改變，最終導致腫瘤惡性特質(zhì)的改變，這可能就是腫瘤細胞TKTL1高表達往往預(yù)示侵襲轉(zhuǎn)移與預(yù)后不良的重要原因之一。至于TKTL1是如何影響HIF-1α表達及其內(nèi)在相互作用的分子機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

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