馬泳泳， 黃 進(jìn)， 周淑娟， 葛杭萍， 俞 康

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種起源于B淋巴細(xì)胞系并能夠產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白(M蛋白)的惡性增生性疾?。?］，中老年人易患，是血液系統(tǒng)第二大常見惡性腫瘤。MM的發(fā)病是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過程，其中遺傳學(xué)異常、骨髓微環(huán)境、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，在MM的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［2-3］。

姜黃素(curcumin)是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的酚類色素。近年被證實(shí)其主要藥理作用是通過調(diào)控特定的靶基因如生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子等發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒等作用［4-6］。已有報(bào)道姜黃素能抑制人體多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等［7-10］。不同的腫瘤細(xì)胞系涉及不同的機(jī)制。姜黃素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用主要集中在其抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及促進(jìn)凋亡，但對(duì)其遷移侵襲能力并無相關(guān)研究。含IQ模序的RasGTP酶活化蛋白1(IQ motif-containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1)是一個(gè)細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白，通過接收和發(fā)射各種信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和細(xì)胞間黏附，促進(jìn)細(xì)胞的遷移［11-12］。我們的前期工作已證實(shí)IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)增高［13］。IQGAP1是否在骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起到重要作用?姜黃素是否能對(duì)IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮的作用有抑制或阻斷?本研究期望為MM的臨床治療提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要藥品和試劑

姜黃素(Sigma)用二甲基亞砜配成8 mmol/L儲(chǔ)存液，使用前用無菌PBS稀釋至工作濃度。RPMI-1640培養(yǎng)液為 Gibco產(chǎn)品，胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購(gòu)自杭州四季青生物公司，其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。Matrigel膠購(gòu)自Becton Dickinson。Costar 3422 Transwell小室購(gòu)自Corning。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng) 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226由溫州醫(yī)學(xué)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)前從－196℃液氮罐中取出，快速?gòu)?fù)蘇后用用含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 IQGAP1沉默及轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞 參照文獻(xiàn)［13］選擇 RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)沉默 IQGAP1。

2.3 IQGAP1蛋白的檢測(cè)

2.3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 RPMI8226細(xì)胞后，收集 RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226組細(xì)胞，行2.3.3步驟實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×109/L密度接種于6孔板內(nèi)。姜黃素 0、20、30及 40 μmol/L作用RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24 h，行2.3.3步驟實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 抽提蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，與1∶500稀釋度的抗IQGAP1抗體和適宜稀釋度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育，經(jīng)Odyssey顯色系統(tǒng)顯色，收集蛋白印跡圖。

2.4 遷移能力的測(cè)定

2.4.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×109/L密度接種于6孔板內(nèi)。細(xì)胞分為姜黃素 0 μmol/L組、20 μmol/L 組、30 μmol/L 組和 40 μmol/L 組，亞組分 3組:RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后行2.4.2步驟遷移實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 將 0.8 μm 孔徑的 Transwell小室套入 24 孔板中，上腔中加入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃放置1 h。收集各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌和重懸各組細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×109/L。小心棄除Transwell小室中的培養(yǎng)液，均勻加入200 μL各組細(xì)胞懸液至小室上腔。通過間隙加入600 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液至下腔，避免產(chǎn)生汽泡，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后將Transwell小室取出。分別收集各組穿過濾膜進(jìn)入小室下腔的細(xì)胞，制成20 μL細(xì)胞懸液。吸取少量懸液充滿計(jì)數(shù)板池，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

2.5 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)

2.5.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×109/L密度接種于6孔板內(nèi)。細(xì)胞分為姜黃素 0 μmol/L組、20 μmol/L 組、30 μmol/L 組和 40 μmol/L 組，亞組分 3組:RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后行2.5.2步驟Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 將－20℃保存的Matrigel，在冰上4℃過夜融化，在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取100 μL Matrigel加入冰預(yù)冷的300 μL無血清培養(yǎng)液中，充分混勻。取上述稀釋的Matrigel 50 μL加入Transwell板上室，覆蓋整個(gè)聚碳酯膜，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成膠。細(xì)胞接種密度為2×108/L。接種方法、觀測(cè)時(shí)間及細(xì)胞收集、計(jì)數(shù)方法同遷移實(shí)驗(yàn)。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)姜黃素作用后IQGAP1 mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×109/L密度接種于6孔板內(nèi)。姜黃素0或40 μmol/L作用于 RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24 h，采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RT-PCR［14］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度姜黃素對(duì)RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞遷移及侵襲力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0 μmol/L姜黃素作用于RPMI8226-shIQGAP1組24 h后，穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)明顯少于RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，差異顯著(P＜0.05);在RPMI8226-shRNA 陰性對(duì)照組，經(jīng)姜黃素20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后的組穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)較0 μmol/L姜黃素組明顯減少，差異顯著(P＜0.05);未轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞經(jīng)姜黃素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后，穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)較0 μmol/L姜黃素組明顯減少，差異顯著(P＜0.05);經(jīng)姜黃素20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后的同一濃度組內(nèi)RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)無顯著差異，見表1。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)也顯示，經(jīng)0 μmol/L姜黃素作用后RPMI8226-shIQGAP1組進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)明顯少于RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，差異顯著(P＜0.05);在RPMI8226-shRNA 陰性對(duì)照組，經(jīng)姜黃素 20 μmol/L、30 μmol/L 和40 μmol/L作用后進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)較0 μmol/L姜黃素組明顯減少，差異顯著(P＜0.05);未轉(zhuǎn)染RPMI8226 細(xì)胞經(jīng)姜黃素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L作用后，進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)較0 μmol/L姜黃素組明顯減少，差異顯著(P＜0.05)。經(jīng)姜黃素20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后的同一濃度組內(nèi) RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)無顯著差異，見表2。

表1 姜黃素對(duì)不同RPMI8226細(xì)胞遷移力的影響Table 1.Migration of RPMI8226 cells treated with curcumin(Mean±SD.n=3)

表2 姜黃素對(duì)不同RPMI8226細(xì)胞侵襲力的影響Table 2.Invasion of RPMI8226 cells treated with curcumin(Mean±SD.n=3)

2 RT-PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)不同RPMI8226細(xì)胞IQGAP1 mRNA表達(dá)的影響

姜黃素0或40 μmol/L作用于RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24 h，RT-PCR結(jié)果提示姜黃素0 μmol/L作用后，RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞表達(dá)IQGAP1 mRNA，而RPMI8226-shIQGAP1組無IQGAP1 mRNA表達(dá);姜黃素40 μmol/L作用后，3組均未見IQGAP1 mRNA表達(dá)，見圖1。

Figure 1.RT-PCR showed the mRNA expression of IQGAP1 in RPMI8226 cells treated with curcumin.圖1 RT-PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)不同RPMI8226細(xì)胞IQGAP1 mRNA表達(dá)的影響

3 Western blotting檢測(cè)姜黃素對(duì)不同RPMI8226細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)的影響

姜黃素 0、40 μmol/L 作用于 RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24 h，Western blotting結(jié)果提示姜黃素0 μmol/L作用后，RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞表達(dá)IQGAP1蛋白，而RPMI8226-shIQGAP1組無IQGAP1蛋白表達(dá);姜黃素40 μmol/L作用后，3組均未見 IQGAP1蛋白表達(dá)，見圖2。

Figure 2.Western blotting showed the protein expression of IQGAP1 in RPMI8226 cells treated with curcumin.圖2 Western blotting檢測(cè)姜黃素對(duì)不同RPMI8226細(xì)胞IQGAP1蛋白表達(dá)的影響

討 論

姜黃素是一種植物多酚，具有多方面的藥理作用如抗腫瘤、抗炎、抗氧化等，其抗腫瘤作用正日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素對(duì)不同組織來源的惡性腫瘤細(xì)胞，如胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、淋巴瘤、白血病等細(xì)胞系都顯示了良好的抗腫瘤活性，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥，具體機(jī)制十分復(fù)雜。但姜黃素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響并無相關(guān)研究。

IQGAPs是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族，IQGAP1是Rho家族GTP酶成員Rac1和Cdc42的一個(gè)重要的效應(yīng)因子，能與細(xì)胞骨架和黏附成分廣泛作用［15-18］，通過調(diào)節(jié)分裂原激活蛋白激酶途徑，可以影響細(xì)胞增殖和分化，在細(xì)胞黏附和遷移的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19-21］。IQGAP1位于染色體15q26上，是基因擴(kuò)增熱點(diǎn)。

在本研究的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，未轉(zhuǎn)染RPMI8226 細(xì)胞經(jīng)姜黃素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L作用后穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)較0 μmol/L姜黃素組明顯減少，差異顯著(P＜0.05);同樣，在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)也顯示未轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞經(jīng)姜黃素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L作用后進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)較0 μmol/L姜黃素組明顯減少，差異顯著(P＜0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:姜黃素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有抑制作用。

shRNA表達(dá)質(zhì)粒沉默IQGAP1后轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞，Western blotting檢測(cè) RPMI8226-shIQGAP1組的IQGAP1蛋白較另2組表達(dá)減少，差異顯著。之后在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，姜黃素0 μmol/L處理RPMI8226-shIQGAP1組24 h后，穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)明顯少于RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，差異顯著(P＜0.05);同樣，在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，經(jīng)0 μmol/L姜黃素作用后RPMI8226-shIQGAP1組進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)明顯少于RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，差異顯著(P＜0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起到重要作用。

姜黃素對(duì)IQGAP1蛋白及mRNA的表達(dá)同樣有抑制作用。在姜黃素40 μmol/L作用于RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24 h，3組均未見IQGAP1蛋白及mRNA表達(dá)，而姜黃素0 μmol/L(對(duì)照組)作用24 h后，RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染 RPMI8226組細(xì)胞可檢到IQGAP1 mRNA及蛋白表達(dá)。

姜黃素是否能對(duì)IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞的遷移侵襲發(fā)揮的作用有抑制或阻斷呢?shRNA表達(dá)質(zhì)粒沉默IQGAP1后轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞，在RPMI8226-shIQGAP1 組，姜黃素0 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L處理組的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)無顯著差異，證實(shí)除IQGAP1的影響因素外可能不存在其它影響RPMI8226細(xì)胞遷移的因素;在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。而在RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，經(jīng)姜黃素 20 μmol/L、30 μmol/L 和40 μmol/L 作用后的同一濃度組內(nèi)穿過濾膜進(jìn)入下腔的細(xì)胞數(shù)無顯著差異，亦提示在姜黃素對(duì)RPMI8226細(xì)胞遷移的抑制作用中，影響因素單一;在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。因此，本研究證實(shí)姜黃素通過抑制IQGAP1的表達(dá)降低骨髓瘤細(xì)胞的遷移力和侵襲力。本研究有望為MM的臨床治療提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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