張英可， 張 林， 齊一鳴， 黃俊琪

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室，廣東廣州510080)

登革病毒(dengue virus，DENV)是一種重要的蚊媒病毒，能夠引起登革熱(dengue fever，DF)和重癥登革熱即登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)，重癥登革熱死亡率極高。最新文獻報道每年登革病毒感染人數(shù)約有39 000萬人［1］。Jaiyen等［2］指出DENV引起外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)凋亡，原因不僅在于病毒本身的毒性作用，也與產(chǎn)生的促炎因子腫瘤壞死因子 α(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)有關(guān)。本課題組之前對細(xì)胞因子的研究發(fā)現(xiàn)，2型登革病毒(dengue virus type 2，DENV2)感染 PBMC 0 h、6 h 和 12 h，隨時間增加TNF-α 的產(chǎn)生減少［3］。

DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分之一，能夠通過影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和染色體的結(jié)構(gòu)引起基因表達(dá)抑制［4］。在脊椎動物中，DNA甲基化多發(fā)生在含高密度CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)的CpG島區(qū)，但是TNF-α啟動子區(qū)不存在典型CpG島結(jié)構(gòu)，僅有散在的CpG雙核苷酸［5］。TNF-α的表達(dá)調(diào)控受多種因素的影響，DNA甲基化修飾在這個過程中起重要作用。本研究通過在PBMC感染病毒后不同時間檢測TNF-α基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，探討甲基化水平對該基因表達(dá)調(diào)控的影響。

材料和方法

1 材料

登革病毒2型 New Guinea C株(DENV2，NGC株)來自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，由本實驗室進行擴增和保存。健康人外周血由廣州市血液中心提供。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco。EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit購自 Qiagen。凝膠純化試劑盒購自Thermo。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng) Ficoll Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，10%胎牛血清及1%青、鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 登革病毒感染 DENV2進行擴增定量，病毒滴度為1×107pfu/L，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1處理細(xì)胞，病毒吸附2 h后棄上清，加入含4%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下孵育6 h或12 h。

2.3 DNA甲基化轉(zhuǎn)化處理 取登革病毒感染0 h、6 h和12 h的細(xì)胞，分別提取DNA，使用EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit對各組DNA進行甲基化轉(zhuǎn)化。

2.4 PCR擴增 對各組甲基化轉(zhuǎn)化后的DNA進行擴增，設(shè)計亞硫酸氫鹽測序PCR甲基化檢測引物，正義鏈 5′-AGGGTTTTATATATAAATTAGTTAGTGGTTTAGAAGA-3′，反義鏈:5′-TATAATTACTTCTCTCCCTCTTAACTAATCCTC-3′，擴增產(chǎn)物大小為 353 bp(-294 bp～+58 bp)。PCR反應(yīng)后取3 μL PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。對凝膠電泳后的各組DNA片段進行純化回收。

2.5 連接 目的片段 DNA 2 μL(約 150 ng)，PMD19-T 載體(TaKaRa)1 μL(約50 ng)，T4 快速連接酶 1 μL，10× Buffer用滅菌去離子水補足10 μL，22℃連接10 min。

2.6 轉(zhuǎn)化 取連接產(chǎn)物加到50 μL T1感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30 min;將上述轉(zhuǎn)化液置于42℃水浴30 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min;向其中加入900 μL 37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)45 min;2 500 r/min離心5 min，將上清液吸走，留 100 μL混勻菌液，加到含AMP抗生素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上(抗生素終濃度50 mg/L)，用無菌的彎頭玻棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開;待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。

2.7 基因測序 挑取上述平板上的單菌落，每組挑選5個克隆送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測序。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

甲基化率以每組擴增序列發(fā)生甲基化的位點數(shù)占總甲基化位點數(shù)的百分率表示。各組間甲基化率差異的比較采用 χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 擴增序列

通過在線工具(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)預(yù)測甲基化位點，人工設(shè)計檢測引物。如圖1所示，箭頭所指為轉(zhuǎn)錄起始位點(transcriptional start site，TSS)，擴增序列為(-294 bp～+58 bp)，覆蓋11個甲基化位點。

Figure 1.The sequence of PCR product.The sequence was from-294 bp to+58 bp，including eleven CpG sites.The arrow indicated the transcriptional start site(TSS).圖1 擴增序列

2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定各樣本擴增產(chǎn)物

PCR反應(yīng)結(jié)束后取各樣本3 μL PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物的大小與理論相符合，見圖2。

3 硫化修飾后的TNF-α基因啟動子區(qū)域部分互補序列的測序結(jié)果

挑取上述平板上的單菌落，每組挑選5個克隆送測序公司測序。序列中未甲基化的C脫氨基變成U，而甲基化的C保持不變，見圖3。

4 TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化水平變化

基因測序結(jié)果顯示，TNF-α基因啟動子區(qū)域-294 bp到+58 bp區(qū)域內(nèi)，11個甲基化位點中，DENV2感染PBMC 0 h和6 h有2個位點發(fā)生甲基化，感染12 h有6個甲基化位點發(fā)生甲基化，甲基化水平呈增高趨勢，見圖4。

感染0 h、6 h和12 h平均甲基化率分別為10.3%、12.1%和25.5%。0 h與12 h及6 h與12 h之間的甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 2.Identification of PCR product of each sample by agarose gel electrophoresis analysis.The size of PCR product was 353 bp，from-294 bp to+58 bp.The PCR products were consistent with the theoretical size.M:DL2000 DNA marker;1～9:PCR products of the samples.圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定各樣本擴增產(chǎn)物

Figure 3.Partial result of complementary sequence of bisulfite-converted TNF-α promoter region.Me-thylated loci were G and unmethylated loci were A in the complementary sequence because methylated C remained unchanged and unmethylated C turned into U，which was combined with A.圖3 硫化修飾的TNF-α啟動子區(qū)域部分互補序列測序結(jié)果

Figure 4.The changes of DNA methy-lation at CpG sites in the promoter region of TNF-α gene.The first and second sites were methylated at 0 h and 6 h，and the first，second，third，seventh，ninth and eleventh sites were methylated at 12 h.●:≥80%methylation at a given site in the sequencing of five individual clones;■○:between 20%and 80%methylation at a given site;○:≤20%methylation at a given site.圖4 TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化水平

討 論

目前登革熱的發(fā)病機制尚未完全明確，細(xì)胞因子風(fēng)暴為重癥登革熱發(fā)病機制的相關(guān)假說之一［6］，登革病毒感染后多種細(xì)胞因子的水平會受到影響。Bozza等［7］的研究證實在重癥登革熱患者中IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-7 和 IFN-γ 等明顯增高，IL-1β、IL-8和TNF-α與血小板的減少有明顯的相關(guān)性。Wati等［8］發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠通過多種機制誘導(dǎo)登革病毒感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Jaiyen等［2］提出 DENV引起PBMC凋亡，除了病毒本身的毒性作用，也與產(chǎn)生的促炎因子TNF-α和IL-1β有關(guān);他們還發(fā)現(xiàn)DHF患者TNF-α顯著高于DF患者，提示TNF-α在重癥登革病毒感染中起重要作用。TNF-α基因?qū)儆谠绶磻?yīng)基因范疇，TNF-α蛋白呈現(xiàn)快速產(chǎn)生、早期分泌、快速下降的規(guī)律。有研究證實LPS刺激THP-1細(xì)胞TNF-α分泌在4 h達(dá)峰之后下降［9］。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)正常人PBMC被DENV2感染0 h、6 h和12 h，隨時間增加 TNF-α 的產(chǎn)生減少［3］。這似乎提示了病毒初次感染與重癥感染的不同，可能是機體在初次病毒感染早期對自身的一種保護機制，避免重癥登革熱的發(fā)生。

TNF-α的表達(dá)調(diào)控受多種因素的影響，DNA甲基化修飾在這個過程中起重要作用。本研究采用亞硫酸氫鹽測序PCR法檢測TNF-α基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，我們的結(jié)果表明病毒感染12 h TNF-α啟動子區(qū)域11個位點發(fā)生甲基化的水平明顯增加，感染6 h與0 h相比甲基化水平相當(dāng)。我們之前的報道［3］，DENV2 感染 PBMC 0 h、6 h 和 12 h，隨時間增加TNF-α的產(chǎn)生減少。這種不同可能是由多因素共同調(diào)控 TNF-α的表達(dá)引起的。郭堯等［5］發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞在LPS刺激之前TNF-α啟動子區(qū)域的CpG雙核苷酸均處于甲基化狀態(tài)，而本實驗中PBMC在病毒感染0 h時就出現(xiàn)多個位點的去甲基化，這可能是細(xì)胞種類差異導(dǎo)致的不同。

本研究證明了PBMC在DENV2感染早期存在TNF-α基因甲基化水平的改變。甲基化能夠調(diào)控蛋白的表達(dá)，且TNF-α蛋白水平與登革熱病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，這可能為治療或緩解登革病毒感染提供新的思路。

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