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        轉(zhuǎn)錄因子IRF8抑制Th17細胞分化并減輕T細胞免疫介導的小鼠結腸炎*

        2014-11-08 02:27:46李慶山杜慶華謝健晉鄧家德余碧珍江雪杰孟凡義
        中國病理生理雜志 2014年1期
        關鍵詞:小鼠

        李慶山, 杜慶華, 謝健晉, 鄧家德, 余碧珍, 江雪杰, 孟凡義△

        炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括克羅恩病(Crohn disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是除了腸道惡性腫瘤以外比較嚴重的慢性腸道疾病,近年來的研究發(fā)現(xiàn)該疾病與腸道黏膜免疫反應失衡有關。雖然目前該病的病因和發(fā)病機制尚不完全明確,但是許多研究認為它是與Th1細胞有關的自身免疫性疾病。目前的研究表明,實驗變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)、膠原誘導的關節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)以及一些腸炎,是由白細胞介素23(interleukin 23,IL-23)依賴的Th17細胞或其它分泌IL-17的淋巴細胞引起的。新型的藥物ustekinumab可以通過阻斷IL-12和IL-23/Th17軸,從而減輕炎癥性腸?。?],提示Th17細胞及其相關細胞因子在炎癥性腸病的發(fā)病機制中起到至關重要的作用,因而中和IL-17A和IL-17F可以作為炎癥性腸病的靶向治療[2-3]。此外臨床常見的自身免疫性疾病特發(fā)性血小板減少性紫癜與大鼠的自身免疫性心肌炎的發(fā)病均與Th17細胞及其相關的細胞因子有關[4-5]。

        干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor,IRF)家族成員與Th17細胞發(fā)育密切相關。它存在于多種類型細胞中,被干擾素 γ(interferon γ,IFN-γ)所誘導。通常IRF8被樹突狀細胞和巨噬細胞中IFN-γ所誘導,但其作為轉(zhuǎn)錄的激活或者抑制劑,依靠于IRF8異源二聚體DNA結合點與其它上皮細胞特異性轉(zhuǎn)錄(epithelium-specific transcription,EST)因子家族和IRF家族轉(zhuǎn)錄因子結合形成不同的復合物有關[6]。IRF家族重要成員之一的IRF4不僅對Th2的發(fā)育至關重要,而且在小鼠EAE模型中,不能發(fā)生EAE與來源于IRF4基因敲除小鼠的Th細胞不能向Th17分化有關,提示有利于向調(diào)節(jié)性T細胞分化[7]。已經(jīng)有研究明確IRF8在髓系細胞分化、促進單核細胞向粒細胞分化中起到關鍵性的作用[8],在DC細胞發(fā)育、分化和功能各個方面也是至關重要的調(diào)節(jié)因子[9],因此對先天性免疫反應的建立是必不可少的。盡管IRF8對免疫細胞的生長、分化和生存的調(diào)節(jié)至關重要[10],但是IRF8對T細胞激活、分化的直接效應仍未被完全揭示。重組激活基因(recombination activating gene,RAG)編碼 Ig分子和 TCR基因重排的重組酶,小鼠RAG1或者RAG2基因被敲除后,Ig和TCR既不能重排也不能表達,表現(xiàn)為T、B淋巴細胞重癥聯(lián)合缺陷。本研究通過轉(zhuǎn)染IRF8全基因敲除和野生型小鼠初始T細胞(CD4+CD45RBhiT細胞)給RAG1-/-小鼠的實驗性腸炎模型研究,探討轉(zhuǎn)錄因子IRF8是否通過對Th17細胞分化的影響而調(diào)控小鼠結腸炎的發(fā)生、發(fā)展。

        材料和方法

        1 動物

        野生型(WT)C57BL/6(B6)小鼠和IRF8全基因敲除(IRF8-/-)C57BL/6(B6)小鼠購自 Jackson′s Lab,均為雄性,均為 9~10周齡,在特殊無菌(specific pathogen free,SPF)級飼養(yǎng)籠飼養(yǎng),溫度18~22℃,濕度50% ~60%。動物實驗方案得到倫理委員會的同意。

        2 脾臟和淋巴結淋巴細胞的分離、純化與處理

        2.1 小鼠淋巴細胞的收集 頸椎脫臼法處死各組供體(WT或者IRF8-/-)小鼠,無菌取脾、淋巴結,用200目篩網(wǎng)碾磨脾臟或者淋巴結,過濾后收集細胞懸液,紅細胞裂解液裂解紅細胞,300×g離心5 min,并用PBS清洗3次,進行細胞計數(shù)。

        2.2 Naive CD4+T細胞的的分選 Naive CD4+T細胞(CD4+CD62L+CD44low)的分選采用熒光激活細胞流式細胞術分選,CD4+T細胞采用抗CD4磁珠(Miltenyi Biotec)和MACS分離柱進行純化(純度可大于95%),為了獲得naive CD4+T細胞,上述獲得的單個細胞懸液加入抗 B220-PE、抗 CD8α-PE、抗CD11b-PE、抗 CD11c-PE和抗 CD49b-PE,所有的單抗均為1∶100稀釋,抗Ter119-PE采用1∶66稀釋,冰上放置20 min,然后與抗PE磁珠(1∶20稀釋)在冰上孵育 20 min,除去的部分加抗 CD4-PECy7、抗CD62L-FITC和抗CD44-APC,細胞分選在流式細胞儀(FACSVantage)上進行,獲得的 CD4+CD62L+CD44lowT細胞,純度>99%。

        2.3 磁珠法分選WT和IRF8-/-小鼠CD4+CD25+Treg細胞 免疫磁珠分選儀(autoMACS Pro Separator)購自Miltenyi Biotec;具體按CD4+CD25+Treg細胞的分選試劑盒說明書進行操作。0.4%臺盼藍染色后檢測細胞活性,流式細胞術檢測細胞純度>99%。

        2.4 Naive CD4+T細胞的體外分化 將上述獲得的naive CD4+T細胞進行體外分化培養(yǎng),細胞加入96孔培養(yǎng)板中,加入抗CD3抗體(1 mg/L;BD Biosciences)和可溶性抗CD28(2 mg/L;BD Biosciences)激活48 h后,加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和離子霉素重新刺激5 h,采用流式細胞術檢測細胞內(nèi)因子。細胞在中性條件(不加細胞因子刺激)下培養(yǎng)為Th0細胞;加入IL-12和抗IL-4(10 mg/L;BD Biosciences)向Th1極化;或者加入IL-4和抗 IFN-γ(10 mg/L;BD Biosciences)向 Th2極化;或者向Th17細胞極化:轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1;5 μg/L)、IL-6(20 μg/L)、IL-23(10 μg/L)(均購自 R&D systems)、抗IL-4(10 mg/L)和抗 IFN-γ (10 mg/L)。

        3 流式細胞術檢測

        上述極化后的細胞,采用IC Fixation緩沖液(BD Biosciences)固定后,采用透膜緩沖液透膜,使用小鼠的抗體,PE-anti-IL-17、APC-anti-IL-4、APC-anti-IFN-γ和PE-Cy5.5-anti-CD4抗體進行細胞內(nèi)染色,在FACSCalibur和 LSRFortessa(BD Biosciences)進行流式細胞術檢測。

        4 實驗性腸炎模型的建立

        按照文獻[11-12]的方法進行T細胞轉(zhuǎn)染的結腸炎模型的建立,簡而言之,按照分選純化 WT和IRF8-/-小鼠的naive CD4+CD45RBhiT細胞和IRF8-/-CD4+CD25+Treg細胞,使用1×PBS 200 μL、經(jīng)過腹腔注射給RAG1-/-受體鼠(每組6只),注射的細胞數(shù)每只均為5×105。每周監(jiān)測受體鼠的體重及臨床表現(xiàn),第5周后處死受體鼠,結腸組織在10%的甲醛緩沖液中固定、石蠟包埋,切成5 μm后蘇木精伊紅(HE)染色,按照評分標準[11]進行結腸病理評分,實驗分組如下:(1)IRF8-/-對實驗性腸炎的影響:根據(jù)供體鼠實驗分為:WT組和IRF8-/-組;(2)IRF8-/-CD4+CD25+Treg細胞對實驗性腸炎的抑制作用:按照注射細胞的來源分為WT-CD4+CD45RBhiT組;②WT-CD4+CD45RBhiT+WT Treg組;③WT-CD4+CD45RBhiT+IRF8-/-Treg組。

        5 統(tǒng)計學處理

        計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD),組間比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗或ANOVA。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結 果

        1 IRF8對小鼠Th1、Th2和Th17分化的影響

        小鼠naive CD4+T細胞在Th17極化條件下,IL-17+CD4+細胞比例在IRF8-/-小鼠顯著高于WT小鼠(P<0.01),而在Th1和Th2極化條件下,Th1和Th2細胞比例在IRF8-/-和WT小鼠中無顯著差異(P >0.05),見圖1。

        2 CD4+CD45RBhiT細胞轉(zhuǎn)染實驗性結腸炎模型

        分別采用 WT或者 IRF8-/-小鼠的 CD4+CD45RBhiT細胞,經(jīng) RAG1-/-小鼠(n=6)腹腔注射,每周觀察小鼠體重的變化,結果顯示注射IRF8-/-小鼠CD4+CD45RBhiT細胞的RAG1-/-小鼠體重顯著低于注射WT小鼠CD4+CD45RBhiT細胞的RAG1-/-小鼠(P<0.05),見圖2;連續(xù)觀察5周后,處死小鼠,注射IRF8-/-小鼠CD4+CD45RBhiT細胞的小鼠結腸病理評分顯著高于WT組(P<0.05),見圖3;腸系膜淋巴結中,IL-17+CD4+T細胞比例IRF8-/-組顯著高于WT組(P<0.01),而Th1(IFN-γ+CD4+)和 Treg(Foxp3+CD4+)細胞比例無顯著差異(P>0.05),見圖4。

        3 IRF8-/-CD4+CD25+Treg細胞對實驗性腸炎的抑制作用

        單獨注射WT小鼠CD4+CD45RBhiT細胞后,與注射Treg細胞2組比較,體重明顯下降(P<0.05),而無論同時注射IRF8-/-或者WT小鼠的Treg細胞,受體鼠體重均未明顯下降,且兩者之間無顯著差異(P >0.05),見圖5。

        Figure 1.Naive CD4+T cells from IRF8-/-or WT mouse spleens were cultured under polarized conditions in vitro.Mean±SD.n=6.**P <0.01 vs WT.圖1 小鼠脾臟naive CD4+T細胞體外極化培養(yǎng)

        Figure 2.Changes of body weight of RAG1-/-mice after injected with WT or IRF8-/-CD4+CD45RBhiT cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs WT CD45RBhi.圖2 RAG1-/-小鼠注射CD4+CD45RBhiT細胞后體重的變化

        討 論

        近年來研究發(fā)現(xiàn)初始CD4+T細胞在不同細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下,除分化出 Th1、Th2和Treg細胞之外,還分化出新型的輔助性T細胞,產(chǎn)生IL-17,即Th17細胞,其除在黏膜防護和病原菌清除中的作用外,在自身免疫性疾病中的作用也得到了較深入的認識[10]。其中Th17及IL-17和炎癥性腸?。?-3]和異基因造血干細胞移植后并發(fā)的移植物抗宿主?。?3-14]密切相關。RORγt是 Th17細胞分化的決定性轉(zhuǎn)錄因子,但是Th17細胞分化也受到一些正反饋和負反饋調(diào)節(jié),如最近報道的IL-21、IL-23R、IL-10和IL-27調(diào)節(jié)反饋圈的調(diào)節(jié)[15-18],提示可能存在固有的基因程序激發(fā)和沉默Th17細胞的發(fā)育,多種轉(zhuǎn)錄因子包括RORγt、RORα、STAT3和IRF4與Th17細胞的分化密切相關[10,15],但是沉默 Th17發(fā)育的機制目前仍然未完全闡明。

        在本研究中,我們闡明了IRF8作為內(nèi)部沉默因子,阻止了初始CD4+T細胞向Th17細胞分化。我們采用了IRF8全基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn),IRF8基因缺失促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化,而對Th1和Th2細胞的分化無影響。我們進一步通過免疫介導小鼠炎癥性腸病的模型研究IRF8對炎癥性腸病的影響,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IRF8-/-的 CD4+CD45RBhiT細胞給RAG1-/-小鼠較WT誘導出更為嚴重的結腸炎,在腸系膜淋巴結的T細胞重建中IRF8-/-的供體鼠較WT供體鼠顯示出更高的Th17細胞比例,表明IRF8抑制Th17的免疫反應與減輕實驗小鼠結腸炎的發(fā)生有關。

        Figure 3.Colonic pathological changes in RAG1-/-mice after injected with WT or IRF8-/-CD4+CD45RBhiT cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs WT CD45RBhi.圖3 RAG1-/-小鼠注射CD4+CD45RBhiT細胞后結腸病理變化

        Figure 4.Percentages of T cell subtypes in RAG1-/-mouse mesenteric lymph nodes after injected with WT or IRF8-/-CD4+CD45RBhiT cells.Mean±SD.n=6.**P <0.01 vs WT CD45RBhi.圖4 注射CD4+CD45RBhiT細胞后RAG1-/-小鼠腸系膜淋巴結中T細胞亞群比例

        Figure 5.Immunosuppressive effect of IRF8-/-CD4+CD25+Treg cells on experimental colitis in mice.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs other groups.圖5 IRF8-/-CD4+CD25+Treg對小鼠實驗性腸炎的免疫抑制作用

        最近在人IBD結腸標本的研究發(fā)現(xiàn),IRF家族中IRF1、IRF5和IRF8表達無顯著增加,而IRF4顯著增加;在鼠的動物模型中,進一步證實IRF4與IL-17啟動子結合,誘導IL-17產(chǎn)生,IL-17誘導表達IL-17R的細胞產(chǎn)生IL-6,促進T細胞RORγt表達,從而誘導炎癥性腸病發(fā)生[19]。IRF8作為轉(zhuǎn)錄激活劑或者抑制劑依靠靶向DNA序列、并與PU.1或E47不同的伙伴蛋白以及IRF其它家族成員相互作用[6]。最近基因組掃描Meta分析顯示IRF8為多發(fā)性硬化患者的易感基因,更加證明了IRF8在免疫調(diào)控的炎癥性疾病中的作用[20]。

        Tregs在維持機體免疫平衡中作用不可或缺,其不僅可避免IBD的發(fā)生,而且可以逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的腸炎[21]。如果體內(nèi) Tregs與 Th17之間失平衡或者Tregs缺乏,抗原的免疫刺激可導致結腸黏膜的炎性反應。動物實驗表明,給T細胞缺陷的小鼠注入不含有Tregs的幼稚T細胞,可誘發(fā)其對腸道共生菌群的高反應性,導致嚴重的自身免疫性結腸炎;同時輸入Tregs則可抑制這類炎癥反應[22]。另有研究表明,剔除小鼠的Treg細胞會使其 T細胞介導的炎癥性疾病(如腸炎)惡化[23]。本研究將WT小鼠CD4+CD45RBhiT細胞轉(zhuǎn)染給RAG1-/-小鼠時分別同時轉(zhuǎn)染W(wǎng)T或者IRF8-/-Treg,探討IRF8-/-Treg對炎癥性腸病的抑制作用,發(fā)現(xiàn)IRF8-/-Tregs發(fā)揮了正常的抑T細胞活性。

        (致謝:本研究在美國紐約大學西奈山醫(yī)學院熊華保副教授悉心指導和大力支持下完成,深表感謝!)

        [1] Rietdijk ST,D′Haens GR.Recent developments in the treatment of inflammatory bowel disease[J].J Dig Dis,2013,14(6):282-287.

        [2] Wedebye Schmidt EG,Larsen HL,Kristensen NN,et al.TH17 cell induction and effects of IL-17A and IL-17F blockade in experimental colitis[J].Inflamm Bowel Dis,2013,18(8):1567-1576.

        [3] Hundorfean G,Neurath MF,Mudter J.Functional relevance of T helper 17(Th17)cells and the IL-17 cytokine family in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis,2012,18(1):180-186.

        [4] 周宏斌,陳志華,李 雯.Th17細胞及白細胞介素17A在慢性氣道炎癥性疾病中的作用[J].中國病理生理雜志,2012,28(3):560-564.

        [5] 韓麗娜,張亞晶,楊庭樹,等.自身免疫性心肌炎大鼠Th1、Th2、Th17亞群免疫反應狀態(tài)[J].中國病理生理雜志,2010,26(10):2033.

        [6] Tamura T,Yanai H,Savitsky D,et al.The IRF family of transcription factors in immunity and oncogenesis[J].Annu Rev Immunol,2008,26:535-584.

        [7] Brüstle A,Heink S,Huber M,et al.The development of inflammatory TH-17 cells requires interferon-regulatory factor 4[J].Nat Immunol,2007,8(9):958-966.

        [8] Weaver CT,Hatton RD,Mangan PR,et al.IL-17 family cytokines and the expanding diversity of effector T cell lineages[J].Annu Rev Immunol,2007,25:821-852.

        [9] Park H,Li Z,Yang XO,et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J].Nat Immunol,2005,6(11):1133-1141.

        [10]Korn T,Bettelli E,Oukka M,et al.IL-17 and Th17 cells[J].Annu Rev Immunol,2009,27:485-517.

        [11]Totsuka T,Kanai T,Nemoto Y,et al.IL-7 is essential for the development and the persistence of chronic colitis[J].J Immunol,2007,178(8):4737-4748.

        [12]Powrie F,Leach MW,Mauze S,et al.Phenotypically distinct subsets of CD4+T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C.B-17 scid mice[J].Int Immunol,1993,5(11):1461-1471.

        [13] Teshima T,Maeda Y,Ozaki K.Regulatory T cells and IL-17-producing cells in graft-versus-host disease[J].Immunotherapy,2011,3(7):833-852.

        [14]Yi T,Chen Y,Wang L,et al.Reciprocal differentiation and tissue-specific pathogenesis of Th1,Th2,and Th17 cells in graft-versus-host disease[J].Blood,2009,114(14):1301-1312.

        [15] Ivano II,Mckenzie BS,Zhou L,et al.The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+helper cells[J].Cell,2006,126(6):1121-1133.

        [16] Yang L,Anderson DE,Baecher-Allan C,et al.IL-21 and TGF-beta are required for differentiation of human Th17 cells[J].Nature,2008,454(7202):350-352.

        [17]McGeachy MJ,Chen Y,Tato CM,et al.The interleukin-23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo[J].Nat Immunol,2009,10(3):314-324.

        [18] Stumhofer JS,Laurence A,Wilson EH,et al.Interleukin-27 negative regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system[J].Nat Immunol,2006,7(9):937-945.

        [19] Mudter J,Yu J,Zufferey C,et al.IRF4 regulates IL-17A promoter activity and controls RORγt-dependent Th17 colitis in vivo[J].Inflamm Bowel Dis,2011,17(6):1343-1358.

        [20] De Jager PL,Jia X,Wang J,et al.Meta-analysis of genome scans and replication identify CD6,IRF8 and TNFRSF1A as new multiple sclerosis susceptibility loci[J].Nat Genet,2009,41(7):776-782.

        [21] Fahlen L,Read S,Gorelik L,et al.T cells that cannot respond to TGF-beta escape control by CD4+CD25+regulatory T cells[J].J Exp Med,2005,201(5):737-746.

        [22] O′Garra A,Vieira P.Regulatory T cells and mechanisms of immune system control[J].Nat Med,2004,10(8):801-805.

        [23] Veltkamp C,Ruhwald R,Giesem T,et al.CD4+CD25+cell depletion from the normal CD4+T cell pool prevents tolerance toward the intestinal flora and leads to chronic colitis in immuno-deficient mice[J].Inflamm Bowel Dis,2006,12(6):437-446.

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