李 晶， 朱再滿， 白家明， 潘群皖△， 李 敏， 虞 冉

阿片類藥物成癮是一種以強(qiáng)迫性用藥、覓藥為核心癥狀的慢性、復(fù)發(fā)性腦?。?］。近年來，有研究顯示［2］，內(nèi)側(cè)前額皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)參與阿片成癮的形成和復(fù)吸過程，其作用機(jī)制與mPFC的學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。邊緣下區(qū)(infralimbic cortex，IL)位于 mPFC 的腹側(cè)［3-4］，是條件性恐懼和藥物成癮記憶消退的重要腦區(qū)。有關(guān)IL區(qū)如何參與阿片成癮的形成過程，IL區(qū)腦電活動(dòng)的改變對(duì)成癮過程有何影響目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過制備嗎啡成癮大鼠條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)模型，在 CPP箱內(nèi)視頻監(jiān)控大鼠CPP行為的改變，同時(shí)利用無線遙測(cè)腦電系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察大鼠IL區(qū)腦電活動(dòng)的相應(yīng)變化，以期從神經(jīng)電生理學(xué)視角探索IL區(qū)在大鼠嗎啡成癮過程中的作用及其腦電活動(dòng)改變對(duì)嗎啡成癮過程的影響，為阿片成癮和復(fù)吸治療另辟新徑。這種針對(duì)阿片成癮大鼠CPP行為變化過程中IL區(qū)腦電活動(dòng)的實(shí)時(shí)記錄與分析，迄今少見報(bào)道。

材料和方法

1 動(dòng)物、主要藥品及儀器

1.1 動(dòng)物 選用成年雄性SD大鼠［合格證號(hào)為SCXK(蘇)2009-0001］24只，SPF級(jí)，體重290～320 g，購(gòu)自蘇州愛爾麥特科技有限公司。自由進(jìn)食、飲水，12 h光照，室溫控制22～25℃。將大鼠隨機(jī)分成2組(嗎啡戒斷組和生理鹽水對(duì)照組)。

1.2 主要藥品 鹽酸嗎啡注射液(皮下注射)，沈陽第一制藥公司，批號(hào)為110508-2，由安徽省醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.3 儀器裝置 大鼠腦立體定位儀(第二軍醫(yī)大學(xué));CPP視頻分析裝置(上海吉量軟件科技有限公司);生理無線遙測(cè)腦電系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

2 方法

2.1 腦立體定位埋植電極手術(shù) 以1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，將其俯臥位(使門齒桿低于耳間連線3 mm，調(diào)整前囟與后囟至同一水平面)固定在腦立體定位儀上。剪毛、消毒，切開頭皮，剝離骨膜，暴露骨縫，參照大鼠腦立體定位圖譜［5］定位左側(cè)IL區(qū)(前囟前3.2 mm，中縫向左旁開0.6 mm，硬膜下5.2 mm)，定位點(diǎn)鉆孔。記錄電極使用直徑0.3 mm的漆包鎳鉻絲，尖端裸露2 mm，植入定位孔硬膜下5.2 mm，同時(shí)放置參考電極于頭皮下，采用自凝牙托粉封固。術(shù)后恢復(fù)7 d，連續(xù)5 d給予青霉素(400 kU·kg－1)抗感染，每天1次。

2.2 嗎啡成癮大鼠CPP模型的制備 模型制備前期，對(duì)大鼠進(jìn)行CPP行為預(yù)測(cè)試。打開CPP裝置的通道隔板，使大鼠在兩箱中自由活動(dòng)15 min，每日1次，共3 d，比較大鼠在兩箱中各自平均停留時(shí)間，同時(shí)采用CPP視頻系統(tǒng)分析軟件繪制大鼠活動(dòng)軌跡圖。比較結(jié)果表明，大鼠均偏愛黑箱，因此模型制備階段，設(shè)非天然偏愛箱(白箱)為伴藥箱。模型制備期，用隔板關(guān)閉黑、白箱間通道。戒斷組大鼠每日皮下注射嗎啡及生理鹽水(NS)各1次［6］，注射嗎啡后投入白箱45 min，注射NS后投入黑箱45 min，2次注射間隔8 h，CPP訓(xùn)練共8 d，嗎啡首日劑量10 mg·kg－1，以后逐日遞增 10 mg·kg－1，至 6 d 達(dá)到 60 mg·kg－1，7～8 d維持該劑量，對(duì)照組大鼠以相同方法注射NS。模型制備結(jié)束后打開通道，于戒斷期1～3 d，通過CPP視頻系統(tǒng)對(duì)大鼠的CPP行為進(jìn)行測(cè)試，計(jì)測(cè)其15 min內(nèi)在白箱中停留時(shí)間，同時(shí)繪制大鼠活動(dòng)軌跡圖。經(jīng)組間比較及組內(nèi)給藥前后對(duì)照，明確大鼠CPP的形成。

2.3 大鼠IL區(qū)腦電的遙測(cè)及分析 記錄方法參照文獻(xiàn)［7］，于造模前及戒斷期，在CPP裝置的視頻箱內(nèi)，使用無線遙測(cè)腦電系統(tǒng)實(shí)時(shí)計(jì)測(cè)各組大鼠在不同行為狀態(tài)下左側(cè)IL區(qū)的腦電活動(dòng)。行為狀態(tài)類型包括:白箱停留、黑箱停留、白－黑箱穿梭及黑－白箱穿梭。利用無線遙測(cè)腦電系統(tǒng)的快速傅里葉變換(fast Fourier transform，F(xiàn)FT)功能處理分析原始腦電，原始腦電圖的橫坐標(biāo)表示腦電信號(hào)的采樣時(shí)點(diǎn)，縱坐標(biāo)表示腦電波幅。高通及低通濾波分別為0.1 Hz和 100 Hz，采樣率 500 Hz。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及重復(fù)測(cè)量的方差分析。若方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 嗎啡成癮大鼠CPP模型檢測(cè)

如圖1和表1所示，注射8 d嗎啡的戒斷組大鼠，戒斷1～3 d在白箱中停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于同階段注射NS的對(duì)照組大鼠(P＜0.01)。與造模前白箱停留時(shí)間相比，造模后對(duì)照組大鼠在白箱中停留時(shí)間無顯著變化(P＞0.05);戒斷組大鼠戒斷1～3 d在白箱中停留時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，并且戒斷組大鼠在白箱中停留時(shí)間隨戒斷天數(shù)增加逐漸延長(zhǎng)，戒斷3 d在白箱中停留時(shí)間最長(zhǎng)，表明戒斷3 d位置偏愛最明顯。上述結(jié)果提示，戒斷1～3 d戒斷組大鼠對(duì)白箱產(chǎn)生穩(wěn)定的CPP，模型檢測(cè)驗(yàn)證制模成功。

Figure 1.The maps of activity tracks of the rats in withdrawal group before and after modeling.A:before modeling;B:withdrawal 1 d;C:withdrawal 2 d;D:withdrawal 3 d.圖1 戒斷組大鼠造模前后活動(dòng)軌跡圖

2 大鼠在黑、白箱中停留或經(jīng)黑、白箱間穿梭時(shí)，IL區(qū)遙測(cè)腦電的變化

造模前，戒斷組大鼠在黑、白箱中停留或經(jīng)黑、白箱間穿梭時(shí)IL區(qū)遙測(cè)腦電與對(duì)照組大鼠同一行為狀態(tài)下的IL區(qū)腦電無明顯差異(P＞0.05)。

造模后戒斷3 d，戒斷組與對(duì)照組大鼠相比，IL區(qū)遙測(cè)腦電表現(xiàn)為:當(dāng)戒斷組大鼠停留于白箱時(shí)，δ波明顯減少(P＜0.05)，β波(以β2波增加為主)明顯增加(P＜0.01)，θ波及α波組間比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖2;當(dāng)戒斷組大鼠停留于黑箱時(shí)，IL區(qū)腦電各波與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3;當(dāng)戒斷組大鼠由黑箱向白箱穿梭時(shí)，IL區(qū)腦電δ波顯著增加(P＜0.01)，α波(包括α1波和α2波)顯著減少(P＜0.01)，β波(包括 β1波和β2波)顯著減少(P＜0.01)，僅θ波組間差異不顯著(P＞0.05)，見圖4;當(dāng)戒斷組大鼠由白箱向黑箱穿梭時(shí)，IL區(qū)腦電各波與對(duì)照組相比無明顯改變(P＞0.05)，見圖 5。

表1 大鼠在白箱中停留時(shí)間比較Table 1.Comparison of the spending time of the rats in the white box(s.Mean ±SD.n=12)

Figure 2.The telemetry electrical activity of left IL when rats stayed in white box on withdrawal 3 d.Mean±SD.n=12.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖2 戒斷3 d大鼠停留于白箱時(shí)左側(cè)IL遙測(cè)腦電活動(dòng)

Figure 3.The telemetry electrical activity of left IL when rats stayed in black box on withdrawal 3 d.Mean±SD.n=12.圖3 戒斷3 d大鼠停留于黑箱時(shí)左側(cè)IL遙測(cè)腦電活動(dòng)

討 論

Figure 4.The telemetry electrical activity of left IL when rats shuttled from black box to white box on withdrawal 3 d.Mean± SD.n=12.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control group.圖4 戒斷3 d大鼠黑－白箱穿梭時(shí)左側(cè)IL遙測(cè)腦電活動(dòng)

Figure 5.The telemetry electrical activity of left IL when rats shuttled from white box to black box on withdrawal 3 d.Mean±SD.n=12.圖5 戒斷3 d大鼠白－黑箱穿梭時(shí)左側(cè)IL遙測(cè)腦電活動(dòng)

阿片類藥物成癮者具有強(qiáng)烈的心理渴求(覓藥動(dòng)機(jī))，在藥物耐受、依賴和強(qiáng)迫戒斷后，一旦藥物相關(guān)環(huán)境線索暴露，覓藥動(dòng)機(jī)引燃，即可產(chǎn)生復(fù)吸。相關(guān)研究顯示，在阿片成癮的形成中，用藥行為由最初的可控性過渡到強(qiáng)迫性用藥，該過程與mPFC的功能異常密切相關(guān)，mPFC是中腦腹側(cè)背蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元的主要投射區(qū)，參與藥物成癮相關(guān)的學(xué)習(xí)、記憶過程［8］。在mPFC中，位于腹側(cè)的IL區(qū)是調(diào)控藥物成癮的重要腦區(qū)之一，主要行使認(rèn)知、行為決策、情緒表達(dá)調(diào)節(jié)等功能［9］。因此本實(shí)驗(yàn)將IL區(qū)作為研究焦點(diǎn)，探討嗎啡成癮大鼠CPP表現(xiàn)最強(qiáng)烈時(shí)期(戒斷3 d)IL區(qū)腦電的變化，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)將為阿片成癮及復(fù)吸機(jī)制的深入研究提供參考。

在IL區(qū)參與阿片成癮形成機(jī)制的長(zhǎng)期探索中，部分研究認(rèn)為IL區(qū)具有覓藥抑制功能，如IL區(qū)注射 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA)和β2腎上腺素能受體激動(dòng)劑可抑制大鼠海洛因覓藥行為恢復(fù)［9］，選擇性失活I(lǐng)L區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)t增加海洛因誘導(dǎo)的大鼠CPP恢復(fù)［10］;進(jìn)一步研究表明IL區(qū)也具有促進(jìn)覓藥功能，如Bossert等［11］報(bào)道IL區(qū)至伏隔核殼部的谷氨酸能投射纖維激活引發(fā)線索誘導(dǎo)的大鼠海洛因覓藥復(fù)燃，注射γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid，GABA)受體激動(dòng)劑至IL區(qū)使其失活，可消退復(fù)燃現(xiàn)象。從上述文獻(xiàn)分析提示IL區(qū)神經(jīng)元的功能或許具有雙重性:即一部分IL區(qū)神經(jīng)元抑制覓藥;而另一部分IL區(qū)神經(jīng)元促進(jìn)覓藥。IL區(qū)的這種雙重性體現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中:(1)戒斷3 d，當(dāng)嗎啡成癮大鼠(與對(duì)照組相比)由黑箱向白箱穿梭時(shí)，IL區(qū)腦電活動(dòng)出現(xiàn)一過性δ波明顯增加，α波(α1、α2)及 β 波(β1、β2)明顯減少，結(jié)果提示 IL 區(qū)神經(jīng)元功能受到短時(shí)壓抑。IL區(qū)是控制沖動(dòng)行為的重要腦區(qū)［12］，阿片類藥物的長(zhǎng)期使用可損害IL區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能，使藥物成癮者對(duì)沖動(dòng)行為控制能力下降。對(duì)嗎啡戒斷大鼠前額聯(lián)絡(luò)皮層的腦電分析研究顯示［13］，嗎啡攝入可引起前額皮層部分神經(jīng)元功能受到抑制、興奮性降低，引起該區(qū)腦電慢波增加?？紤]本實(shí)驗(yàn)中受抑制的部分IL區(qū)神經(jīng)元，可能參與對(duì)大鼠覓藥行為的抑制性調(diào)控(IL抑制區(qū))，當(dāng)其功能受到壓抑時(shí)，對(duì)大鼠覓藥沖動(dòng)的控制力削弱，則大鼠向白箱穿梭覓藥行為表達(dá)增強(qiáng)。(2)當(dāng)嗎啡成癮大鼠進(jìn)入白箱并停留時(shí)，IL區(qū)腦電呈現(xiàn)δ波顯著減少，β波(主要是β2)顯著增加。有研究發(fā)現(xiàn)［14-15］，藥物相關(guān)環(huán)境線索暴露可激活中腦腹側(cè)背蓋區(qū)→杏仁核→IL區(qū)的投射通路，通過IL區(qū)激活的部分神經(jīng)元集群進(jìn)一步編碼和調(diào)控阿片獎(jiǎng)賞效應(yīng)與藥物相關(guān)環(huán)境線索聯(lián)合的學(xué)習(xí)過程。在本實(shí)驗(yàn)中，嗎啡成癮大鼠停留于白箱(伴藥箱)時(shí)，藥物相關(guān)環(huán)境線索的充分暴露可能激活了具有促進(jìn)覓藥功能的IL區(qū)神經(jīng)元，使其腦電呈現(xiàn)慢波(δ波)減少，快波(β波)增加的趨勢(shì)。(3)當(dāng)嗎啡成癮大鼠由白箱向黑箱穿梭或停留于黑箱時(shí)，IL區(qū)腦電各波與對(duì)照組比較無顯著差異。表明在上述行為狀態(tài)下，嗎啡成癮大鼠IL區(qū)腦電活動(dòng)未發(fā)生特異性改變;黑箱(非伴藥箱)作為非藥物相關(guān)環(huán)境線索，在IL區(qū)腦電活動(dòng)的改變過程中未產(chǎn)生顯著影響。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，嗎啡成癮大鼠穿梭覓藥與停留于藥物相關(guān)環(huán)境線索中引發(fā)的IL區(qū)腦電活動(dòng)改變可能存在不同機(jī)制;IL區(qū)神經(jīng)元功能在大鼠嗎啡成癮過程中或許起雙重調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在給予大鼠嗎啡注射8 d后，具有抑制覓藥功能的IL區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)功能障礙，不能有效遏制覓藥動(dòng)機(jī)及其行為;具有促進(jìn)覓藥功能的IL區(qū)神經(jīng)元在嗎啡作用下出現(xiàn)激活，可增強(qiáng)動(dòng)物覓藥渴求。伴隨不同神經(jīng)元功能的改變，IL區(qū)相應(yīng)部位產(chǎn)生特征性的生物電變化，例如嗎啡成癮大鼠由黑箱向白箱穿梭時(shí)，抑制覓藥功能的IL區(qū)神經(jīng)元表現(xiàn)興奮性降低，促進(jìn)覓藥功能的IL區(qū)神經(jīng)元少量激活，綜合腦電活動(dòng)改變?yōu)槁ɑ顒?dòng)增多;當(dāng)嗎啡成癮大鼠進(jìn)入白箱并停留時(shí)，少量激活的IL區(qū)促進(jìn)覓藥功能的神經(jīng)元在充分場(chǎng)景暴露下進(jìn)一步激活，這種神經(jīng)元的興奮引起的腦電快波掩蓋了IL區(qū)抑制覓藥功能神經(jīng)元的慢波活動(dòng)，因此成癮大鼠白箱停留腦電表現(xiàn)為快波增多。

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